4. 基因检测效率：每个 spot 检测到的基因数量与基因饱和度曲线

聊完了测序质量和比对，咱们来看看更实在的东西——基因检测效率。说白了，就是你花了那么多钱做实验，每个 spot 到底检测到了多少基因？数据饱和了没有？

我个人习惯把这两个指标放在一起看，因为它们就像一枚硬币的两面。一面是“量”——每个 spot 能抓到多少种基因；另一面是“质”——测序深度增加了，还能不能挖出新基因来。

4.1 每个 spot 检测到的基因数量

这是最直接的 QC 指标。通常我们用 n_genes_by_counts 或者 total_genes 来表示。这里的核心问题是：多少算正常？多少算异常？

我建议先看中位数，别被平均值骗了。曾经我在一个脑组织的 Visium 数据里，平均值看着有 2500，但一看分布，发现有一半的 spot 低于 1500。这就是典型的分布偏倚。

具体怎么算？看代码：

import scanpy as sc
import numpy as np

# 加载数据
adata = sc.read_visium('path/to/spatial/')

# 计算每个 spot 的基因数
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, expr_type='counts')

# 查看分布
median_genes = np.median(adata.obs['n_genes_by_counts'])
print(f'Spot 中位基因数: {median_genes}')

# 标记低质量 spot
adata.obs['low_genes'] = adata.obs['n_genes_by_counts'] < 500
print(f'低质量 spot 数: {adata.obs["low_genes"].sum()}')

这里有个坑要注意。有些 spot 基因数特别高，比如超过 6000，不一定就是好事。为什么？因为可能是组织边缘或褶皱区域捕获了太多背景 RNA。嗯，我处理过一个淋巴瘤样本，边缘区域基因数暴增到 8000 多，但那些基因大部分是核糖体蛋白和线粒体基因——说白了，技术噪音。

4.2 基因饱和度曲线

基因饱和度曲线，听起来挺玄乎，其实没那么复杂。它回答的就是一个问题：再测更多 reads，我还能不能发现新基因？

曲线的横轴是测序深度（每个 spot 的总 UMI 数），纵轴是检测到的基因数。曲线陡峭上升，说明还没饱和；曲线开始变平，说明快饱和了。

曲线形态	含义	我的建议
持续上升，斜率 > 0.3	远未饱和，深度不足	考虑加测，或接受低检测率
中度弯曲，斜率 0.1-0.3	部分饱和，尚可接受	正常范围，继续分析
接近平坦，斜率 < 0.1	接近饱和，深度充足	完美，可以放心做差异分析

绘制饱和度曲线其实很简单，用 Python 就能搞定：

import matplotlib.pyplot as plt
import numpy as np
import seaborn as sns

# 从 adata 中提取 UMI 数和基因数
umi_per_spot = adata.obs['total_counts']
genes_per_spot = adata.obs['n_genes_by_counts']

# 绘制散点图 + 拟合曲线
plt.figure(figsize=(8, 6))
sns.scatterplot(x=umi_per_spot, y=genes_per_spot, s=5, alpha=0.5)

# 分箱计算均值用于拟合曲线
bins = np.linspace(umi_per_spot.min(), umi_per_spot.max(), 50)
bin_means = []
for i in range(len(bins)-1):
    mask = (umi_per_spot >= bins[i]) & (umi_per_spot < bins[i+1])
    if mask.sum() > 0:
        bin_means.append(genes_per_spot[mask].mean())
    else:
        bin_means.append(np.nan)

plt.plot(bins[:-1], bin_means, color='red', linewidth=2, label='饱和度曲线')
plt.xlabel('每个 spot 的总 UMI 数')
plt.ylabel('检测到的基因数')
plt.title('基因饱和度曲线')
plt.legend()
plt.show()

我曾经在一个新手的数据里看到，饱和度曲线在中低深度区域就变得很平——这其实是 library complexity 太差。为什么？因为建库时 PCR 扩增偏好性导致只有少数高表达基因被放大，其余的基因压根就检测不到。这就是个典型的实验质量问题，不是测序深度能补救的。

4.3 综合判断：这两个指标怎么看？

单独看一个指标容易误判。举个例子：一个 spot 基因数很高，但饱和度曲线也很陡，说明深度还远远不够，高基因数只是因为组织本身基因表达丰富。这时候盲目过滤反而会丢掉好数据。

反过来，基因数低 + 曲线平坦，这才真正值得警惕。说白了，就是既没检测到足够基因，深度增加也救不回来。这种 spot 我建议直接标记排除。

下面这张图可以帮你理清判断逻辑：

4.4 实际项目中的阈值设置

你可能会问，阈值到底设多少？说实话，没有放之四海而皆准的数值。不过我可以分享几个我在不同平台上的经验值。

对于 10x Visium v2 试剂盒：

• 理想：中位基因数 > 2000，饱和度曲线在 15000 UMI 后趋于平坦
• 可接受：中位基因数 1000-2000，曲线仍在缓慢上升
• 低质量：中位基因数 < 500，或曲线在低深度就饱和

对于 Slide-seq v2：

• 由于 bead 尺寸小，每个 spot 的中位基因数通常在 500-1500 之间
• 饱和度曲线通常更平坦，因为深度普遍偏低

这里要特别提醒：不要把不同平台的阈值搬来直接用。曾经有个团队用 Visium 的阈值去过滤 Slide-seq 数据，结果滤掉了 80% 的 spot，差点整个实验报废。

好了，基因检测效率这块的核心内容就这么多了。记住一句话：基因数看分布，饱和度看趋势，两者结合才能做出靠谱的过滤决策。