📚 课程目录第3章 UMI计数与过滤

3. UMI 计数与过滤：去重原理、有效比例与同源序列处理

哈，聊到 UMI（Unique Molecular Identifier，独特分子标识符）了。这是空间转录组 QC 里我最喜欢的一个环节。为什么？因为它直接关系到你最终拿到的那个基因表达矩阵到底靠不靠谱。

你可能听过一句话：「空间转录组的数据质量，一半看 UMI 去重做得好不好。」这话不夸张。我在好几个项目里都见过，明明组织切片做得很漂亮，结果一跑 QC，有效 UMI 比例低得可怜——说白了，大量数据其实是被 PCR 重复浪费掉了。

好，我们一步步拆开来看。先从最基础的 UMI 去重原理说起。

3.1 UMI 去重原理：到底在去什么？

UMI 说白了就是一段随机的核苷酸序列，长度从 8 bp 到 12 bp 不等。在建库的时候，每一个 mRNA 分子都会被打上一个独一无二的标签——你把它理解为分子条形码就行。

测序后，同一条 mRNA 会产生多个测序 read，但这些 read 都会带着同一个 UMI。所以，如果我们看到多组 read 拥有完全相同的 UMI + 空间条码 + 基因映射，那它们大概率来自同一个原始 mRNA 分子。这时候，我们只保留一条就够了。

嗯，具体流程可以这样理解：

第一步：读出 UMI 序列。注意，这里 UMI 的碱基质量非常关键。
第二步：按「空间条码 + 基因 ID + UMI 序列」进行分组。
第三步：每组只保留一条 read（通常是 UMI 质量最高的那条）。
第四步：扔掉其他所有重复 read。

这就是最经典的 UMI deduplication。但这里有个坑——如果 UMI 本身有测序错误，那原本是同一个分子的 read，可能因为一两个碱基错误被分到不同组去了。我刚刚接触这个领域时就吃过这个亏，结果去重后 UMI 数目反而膨胀了。嗯，后来我养成了一个习惯：在去重前先做 UMI 校正。

下面这个图可以帮你快速理解 UMI 去重的完整逻辑：

3.2 有效 UMI 比例（UQI）：你的文库还剩多少有价值的数据？

有效 UMI 比例，我习惯叫它 UQI（UMI Quality Index）。计算公式很简单：

UQI = 去重后 UMI 数 ÷ 去重前 UMI 数

举个例子：一个 spot 捕获了 5000 个 UMI，经过 deduplication 后剩下 1800 个有效 UMI，那 UQI = 0.36。这意味着什么？意味着原始数据里有 64% 的 UMI 对应的是同一个分子——说白了，你的建库效率或者测序深度产生了大量的冗余。

我个人习惯的 UQI 阈值参考：

UQI 范围	文库质量说明	建议操作
> 0.55	文库复杂度极高，数据利用率好	信心十足，进入下游分析
0.35 – 0.55	中等，可接受	正常分析，留意个别低 UQI spot
0.20 – 0.35	偏低，存在冗余过多或低质量 UMI	强烈建议排查建库和测序过程
< 0.20	极低，基因组表达信号被严重压缩	考虑重新建库或调整捕获参数

你想想看，如果 UQI 只有 0.1，意味着你 90% 的 UMI 其实都是噪音。这时候你用这些数据做差异表达分析，结果能信吗？反正我是不敢直接用。

3.3 低 UQI 的常见病因排查

为什么 UQI 会低？我在项目中遇到过三种典型情况：

PCR 循环过多：这是最常见的原因。PCR 扩增越狠，同一个 UMI 的复制品就越多。去重后有效比例自然下降。
测序深度过高：测得太深，每个 UMI 被覆盖几十甚至上百次。表现上看是数据量大，但有效 UMI 数并没有增加。
UMI 碱基质量差：低质量 UMI 无法被正确读取，导致去重算法出错——原本一个 UMI，由于测序错误被识别成多个，去重不干净。

我记得有个项目，建库时 PCR 循环数从 12 增加到了 18，结果 UQI 直接从 0.45 掉到了 0.19。你说亏不亏？那时候我就在想，一定要在实验设计阶段就把 PCR 循环控制好。

小技巧：

如果你用的是 10x Genomics 的 Visium 数据，可以检查一下 possorted_genome_bam.bam 中每张标签的 UB tag 对应的 UMI 质量。如果 UMI 质量普遍低于 Q20，那就是测序仪器或试剂出了问题。

3.4 同源序列处理：一个 UMI 漏网之鱼都不能放过

好，讲到这里，我们进入最麻烦的一个环节——同源序列处理。什么是同源序列？简单说就是：两个或更多不同的 UMI，它们原本来自同一个 mRNA 分子，但由于 UMI 扩增或测序过程中产生了 1～2 个碱基的变异，导致它们看起来像是不同的 UMI。

举个例子：

原始 UMI: ATCGATCG
错误 UMI1: ATCGATCC  (最后一个碱基 T→C)
错误 UMI2: ATCGATCG  (正确)
错误 UMI3: ATCGATCA  (最后一个碱基 T→A)

如果不去管同源序列，这些看起来是 3 个不同的 UMI，但其实是同一个分子被重复统计了。结果就是：你的 UQI 比实际还要虚高，但基因表达量却被低估了，因为同一个分子被分到了多个桶里。

怎么处理？我推荐的做法是 Hamming 距离 ≤ 1 的 UMI 合并。意思是：如果两个 UMI 的序列差异不超过 1 个碱基，就把它们视为同一个分子，合并并保留质量更高的那一条。

具体的处理流程，我在一个项目中写了个小脚本：

# 伪代码示例：同源 UMI 合并
# 输入：按 CB + Gene 分组的 UMI 集合
# 输出：合并后的唯一 UMI 列表

def dedup_umi_similar(umi_set, max_hamming_distance=1):
    """
    基于 Hamming 距离合并相似 UMI
    """
    import itertools
    
    # 按 UMI 质量排序（降序）
    sorted_umis = sorted(umi_set, key=lambda x: x.quality, reverse=True)
    
    final_umis = []
    used = set()
    
    for umi in sorted_umis:
        if umi.seq in used:
            continue
        # 查找与当前 UMI 差异 ≤ 1 的所有邻居
        for other_umi in sorted_umis:
            if other_umi.seq in used:
                continue
            if hamming_distance(umi.seq, other_umi.seq) <= 1:
                used.add(other_umi.seq)
                # 只保留质量最高的那个（已在 sorted_umis 中排好）
        final_umis.append(umi.seq)
    
    return final_umis

嗯，这里要注意：Haming 距离的阈值设置要谨慎。我之前设过 2，结果把一些确实不同的稀有分子也合并了，导致假阴性。现在我一般用 1，除非数据质量极差（UMI 错误率 > 5%）才考虑放宽到 2。

避坑指南：

我曾经遇到过一个坑：某批次数据 UMI 长度是 10 bp，但我用的去重工具默认了 8 bp 的 UMI 长度。结果所有 UMI 的最后 2 个碱基都被截断了，去重时错把很多不同分子合并了。那个项目的 UQI 明明很高，但下游分析却一塌糊涂——最后排查了整整两天才发现是参数问题。所以，一定要确认 UMI 长度和你的工具配置一致。

3.5 总结一下本章重点

好了，内容不少，我来帮你收一下：

UMI 去重的核心是把「同分子多 read」合并成一条，减少 PCR 冗余。
UQI（有效 UMI 比例）是衡量文库复杂度最直接的指标，建议保持在 0.35 以上。
低 UQI 排查方向：PCR 循环 > 测序深度 > 碱基质量。
同源序列处理要善用 Hamming 距离 ≤ 1 的合并策略，但不要过拟合。