1. 空间转录组QC概述：定义、意义、常用数据类型与平台差异

大家好，我是老周。在这个领域摸爬滚打了好几年，今天咱们来聊聊空间转录组的质量控制——QC。说白了，QC就是给数据“体检”。你拿到的原始数据，就像刚采回来的矿石，里面有金子也有泥沙。QC就是替你筛掉泥沙，把能用的金子挑出来。

1.1 什么是空间转录组QC？为什么它这么重要？

空间转录组技术，说白了就是在组织切片上同时测量基因表达和空间位置。这玩意儿比普通单细胞测序多了一个维度——空间信息。但多一个维度，就多一堆坑。QC的目的，就是确保你后续分析中看到的“空间表达模式”不是假的，不是技术偏差造成的。

我个人习惯把QC分成三个层次：

• 基础QC：检查测序质量、比对率、UMI 分布——这些都是常规转录组的通用QC指标。
• 空间QC：重点检查组织覆盖度、斑点（spot）空置率、组织边缘效应——空间特有的问题。
• 生物学QC：检查基因检出率、组织类型区分度、空间自相关性——确保数据有意义。

你想想看，一个组织切片，可能只有几万个细胞。每个斑点可能捕获了几个到几十个细胞。如果斑点里 RNA 降解了、或者组织切歪了、或者被气泡污染了——这些在常规转录组里可能直接扔掉的样本，在空间转录组里却没法简单丢弃，因为你丢一个切片，可能就丢了一个病人的完整组织信息。

1.2 常用数据类型与各自的QC要点

空间转录组的数据类型比单细胞多了不止一点点。我在项目中最常接触的，大概有这么几类：

数据类型	来源	QC主要检查点	常见问题
HE 染色图像	组织切片染色 + 扫描仪	焦点模糊、组织裂片、染色不均、气泡	气泡遮挡斑点；组织切片翻卷导致边缘信号丢失
空间条形码捕获阵列	设备专用芯片（如 Visium 载玻片）	斑点布局完整性、捕获效率、组织覆盖度	边缘斑点捕获不到组织；死区斑点（气泡或灰尘覆盖）
基因表达矩阵	测序后定量 -> 按斑点汇总	UMI 数分布、基因数分布、线粒体比例、双胞比例	低活性组织导致 UMI 数普遍偏低；坏死区域线粒体比例暴增
空间坐标 / 空间邻接矩阵	条形码位置解码 + 图像配准	坐标变换误差、配准偏移、斑点 - 像素对齐	配准偏差导致表达数据与组织位置错位
组织区域注释	病理学家手动标注 / 自动分割	区域边界是否平滑、是否与表达聚类一致	坏死区被错误标注为肿瘤区，导致虚假空间表达模式

1.3 平台差异导致的QC关注点不同

做空间转录组，绕不开平台对比。目前主流的有 10x Visium、Slide-seq、MERFISH 等。每个平台的数据结构都不一样，QC指标也就各有侧重。

10x Visium

这是目前最常用的平台。它的特点是斑点直径 55 μm，相邻斑点中心间距 100 μm，能够获得比较弱的空间连续性。QC上，我最关注的是：

• 组织覆盖度：一般要求 ≥ 50% 的斑点覆盖到组织切片上。
• UMI 计数：中位数通常要求在 500～2000 之间（取决于组织类型）。
• 空斑鉴别：使用 Visium 自带的 emptyDrops 方法识别真实组织斑点和背景斑点。

Slide-seq (V2)

这个平台使用毫米级直径的玻片铺满 DNA 条形码珠子（直径约 1 μm），分辨率更高。但它的QC挑战在于：

• 珠子有效率：部分珠子可能没有捕获到组织，或者条形码质量差。
• UMI 计数碎片化：单细胞级别的分辨率导致 UMI 计数偏低，更容易受测序深度影响。
• 空间坐标映射：需要将条形码珠子的解码坐标映射到组织图像上，这一步误差很大。

MERFISH (多重抗误差荧光 in situ 杂交)

MERFISH 是成像为基础的，每一帧图像包含上千个 RNA 分子。QC关注点完全不一样：

• 信噪比：RNA 分子点需要与背景噪声区分开。我遇到过一些组织因为染色残留造成假阳性的“RNA 点”。
• 密度偏差：细胞核区域的 RNA 密度通常会偏高，这是成像方法的固有偏差。
• 分子解码准确性：取决于条形码库的质量和成像轮次。

1.4 不同平台的数据存储差异

这个细节很多人不注意，但坑很多。每个平台输出数据的主文件夹结构都不同，QC脚本需要针对性地读取。

10x Visium 的输出目录通常长这样：

sample_name/
├── filtered_feature_bc_matrix.h5
├── raw_feature_bc_matrix.h5
├── spatial/
│   ├── tissue_hires_image.png
│   ├── scalefactors_json.json
│   └── tissue_positions_list.csv

Slide-seq 则不一样：

puck_name/
├── puck_name.barcodes.tsv.gz
├── puck_name.molecules.tsv.gz
├── puck_name.beads.masked.barcodes.txt
└── alignment/

MERFISH 更复杂：

experiment/
├── segmented_cells/
├── cell_gene_matrix.csv
├── all_molecules.csv
└── metadata/

注意：如果你要写通用的QC工具，务必设计一个平台适配器。我见过好多人直接硬编码10x格式，然后在处理MERFISH数据时全盘崩溃。

1.5 空间转录组QC的常见误区

这些年我看到太多人走了弯路。这里列几个经典误区：

• 只看总UMI数，不看空间分布。总UMI数正常，但可能所有信号集中在组织边缘或一个角落。没有空间均一性检查，后续聚类会得到虚假的空间区域。
• 只过滤低质量斑点，不做全局质量评估。有些斑点质量低是因为组织坏死，而这些坏死区域恰恰是研究关注的（比如肿瘤中心坏死区）。
• RNA质量不做组织匹配。有些RNA完整性本身很差，但组织切片看上去完好。实际操作中，我建议给RNA质量评分，并和质量好的斑点做对齐。

1.6 本章知识体系概览

为了让你对整个章节的逻辑有个整体概念，我画了一张图：

从这张图你可以看到，整个空间转录组QC的知识体系是一个层层递进的结构。我们先搞清楚“为什么做QC”，再到“对你拿到的数据进行分类检查”，进一步落到“不同平台有什么特殊坑”，最后给出“实操中常见的错误习惯”。

1.7 本章小结

这一章我们打了基础。对空间转录组QC我总结了几个关键点：

• QC不是数据清洗的第一步，而是贯穿全部预处理流程的。
• 不同数据类型有完全不同的QC指标，单独看基因表达矩阵会遗漏很多问题。
• 平台之间差异很大，QC标准不要互搬，要针对性地设计。