2. 原始测序数据QC：FastQ质量评估、接头污染检测、碱基分布检查

拿到测序仪下机的数据，第一件事就是打开 FastQ 文件看一眼。这个环节说白了就是给你的数据做个体检——质量行不行、有没有混入接头、碱基分布是不是正常。我见过不少新手直接跳过去跑流程，结果跑出来全是垃圾比对。嗯，一步一步来，先把原始数据的脉把好。

FastQ 文件长什么样？

FastQ 是测序最通用的原始数据格式，每四条记录一条序列。我刚开始接触的时候老记不住哪些行是啥，后来记住「标题、序列、+、质量」四个一组就好了。

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

第二行是碱基序列，第四行是质量字符。质量字符对应一个数值（Phred 质量分），数值越高代表测错的概率越低。换算公式很简单：Q = -10 * log10(P)，比如 Q30 表示错误率 0.1%。实际项目中 Q30 占比低于 80% 的样本我一般会打个问号，得看看是不是测序批次出了问题。

质量评估指标：别只看平均值

跑个 fastqc 是最常见的做法。我个人习惯在项目开始前写个批量脚本把每个样本的 FastQC 报告都生成一遍，然后统一提取关键指标。

指标 正常范围 警告阈值 失败阈值
Per base sequence quality Q30比例 > 80% Q30 < 80% Q30 < 60%
Per sequence quality scores 均分 > 30 均分 < 30 均分 < 25
GC content 理论值 ±5% 超出±10% 超出±20%
N content < 1% > 1% > 5%
Adapter contamination < 0.5% 0.5% ~ 5% > 5%

你想想看，如果某个窗口的碱基质量突然掉到 Q20 以下，那很可能就是测序反应不稳定或者文库有气泡。我在一个肿瘤项目里遇到过整条 lane 的前 10 个 cycle 质量都很好，但从第 11 cycle 开始直线下降——后来发现是试剂上机前冻融次数太多。这种细节不做逐个窗口的检查根本发现不了。

小技巧：用 multiqc 把所有 FastQC 报告聚合在一起看，一眼就能看出哪个样本异常。命令极简： 
multiqc .

自动扫描当前目录所有 fastqc* 文件夹生成汇总报告。

接头污染检测：最常见的坑之一

接头污染说白了就是测序读了不该读的片段。建库时需要加接头，如果片段长度太短或者测序读长太长，就会读到接头序列。我刚开始做空间转录组时，有一次批量处理数据，发现比对率只有 20%，排查了两天才意识到是接头没去干净。

FastQC 的 "Overrepresented sequences" 模块会标注常见的接头类型，比如 Illumina 的 TruSeq 接头、Nextera 接头。但你也要注意——空间转录组有些定制化接头，FastQC 可能认不出来。这时候我一般会手动跑 cutadapt 看接头计数。

cutadapt --action=none -a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA \
  -a AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT \
  ../data/sample_R1.fastq.gz -o /dev/null | grep "Reads with adapters"

这个命令不实际剪切，只统计含接头的 reads 比例。如果比例超过 2%，我就得考虑用 trim_galore 或者 fastp 做自动化切除。

注意：不要一上来就把所有 reads 都硬切固定长度。我见过有人固定切掉前 10 bp，结果把有意义的生物学序列切没了。正确的做法是先检测接头位置，再按实际情况裁剪。

碱基分布检查：ATCG 平衡了吗？

理想的测序数据里，每个位置 A、T、C、G 的比例应该接近 25%。如果某个位置的碱基比例严重偏离，比如全是 A 或者全是 T，那有可能是 PCR bias 或者文库扩增不均匀。空间转录组的 poly-A 捕获策略会导致 3' 端 A 比率偏高，这是正常的，但前端就应该分布均匀。

我一般会从 FastQC 的 "Per base sequence content" 图来识别异常。正常情况下四种颜色的线应该是平行且接近的，如果某条线突然飞上去，那个位置大概率有问题。

经验值：我在一个 FFPE 样本的数据里看到前 20 bp 的 GC 含量猛降到 10%，后来发现是组织降解导致的 3' 端偏好。这种情况不去做质控直接往下游分析，差异表达结果会全是假阳性。

另一个容易被忽略的是 N 含量。N 表示测序仪无法判读的碱基，正常应低于 1%。如果某个窗口 N 比例高于 5%，那测序肯定出了大问题。我曾在一次芯片清洗后数据全篇 N——后来查明是流动槽没洗干净，残留的荧光信号干扰了碱基判读。

一张图看懂原始测序 QC 流程

我把整个原始测序数据 QC 的检查项和决策流画成了下面的结构图，你对照着自己的数据一步步走就行。

原始测序数据QC核心流程 原始 FastQ 文件 质量评估 Per base quality Per sequence quality Q20 / Q30 比例 接头污染检测 Overrepresented seqs Adapter 计数统计 cutadapt 手动验证 碱基分布检查 ATCG 含量分布 GC 含量偏移 N 比例检查 是否通过？ ✅ 进入下游分析 ⚠️ 重新建库/测序 注：失败阈值 Q30<60% 或接头>5% 或 N>5%

这张图的核心逻辑是：从原始 FastQ 出发，并行做质量评估、接头检测和碱基分布检查，三项都通过才能放行。我在实际项目中还会加一道手动复核：比如 Q30 明明挺高但 GC 含量明显偏离的，我仍然会标记为待审——防止自动化工具的盲区。

实战口诀：
Q30 不过重测序，接头污染需修剪，GC 偏移查文库，N 太多直接扔。

综合 QC 报告：怎么判断能不能用？

有时候所有单项指标都在警示线边缘，比如 Q30 = 78% 略低于 80%，接头比例 = 0.6% 略超 0.5%。这种灰色地带怎么办？我的做法是：

  • 看看是单端质量差还是两端都差。空间转录组常用双端测序，如果只是 R2 质量稍低，一般可以接受。
  • 和同批次其他样本对比。如果所有样本都是同样的问题，可能是批次效应而非个别异常，可以继续但要记录。
  • 保守起见，先做轻度修剪（比如切除两端质量差的碱基）再重新评估。

我曾经在一个大项目里遇到过整批 96 个样本的接头比例都在 10% 左右，当时团队想直接全扔。我建议用 fastp 做一把批量修剪，结果修剪后接头比例降到 0.3%，数据完全能用。所以说，质控的目的是发现问题并解决问题，而不是机械地丢弃数据。

批量自动化建议：写一个 shell 脚本配合 fastp -i in.R1.fastq.gz -I in.R2.fastq.gz -o out.R1.fastq.gz -O out.R2.fastq.gz --detect_adapter_for_pe 就能自动检测并裁剪双端接头。配合 multiqc 统揽全局，效率翻倍。
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