3. 生物过程关键变量与近红外可测性
近红外（NIR）光谱在生物过程分析中能否真正发挥作用，取决于一个前置问题：过程里哪些变量值得测、哪些变量NIR测得到、测到的信号又能否稳定对应到目标变量。这一节围绕CQA与CPP的界定、主要代谢物与产物的NIR响应特性，以及可测性评估方法展开，目的是让读者在建立NIR模型之前，先判断“该不该测、能不能测、怎么验证能测”。
一、CQA与CPP：先分清“结果指标”和“过程杠杆”
关键质量属性（CQA）是决定产品安全性与有效性的可测量属性，例如产物蛋白的浓度、糖基化程度、聚集体比例、电荷异构体分布、宿主细胞蛋白残留等。关键过程参数（CPP）是影响CQA的过程输入或状态量，例如温度、pH、溶氧、补料速率、葡萄糖浓度、乳酸浓度、氨浓度、谷氨酰胺浓度、细胞密度与活率。二者的关系不是并列，而是因果链：CPP通过细胞代谢影响CQA，NIR通常直接测量的是CPP中的化学成分，再通过模型间接推断CQA。
在细胞培养与发酵中，一个常见的误区是把所有能测的变量都当作CPP。实际上，只有经过工艺表征证明其对CQA有显著影响、且需要被控制在特定范围内的参数，才应被纳入CPP清单。例如在CHO细胞培养中，葡萄糖浓度长期低于0.5 g/L会诱导凋亡并改变糖基化，因此葡萄糖浓度是CPP；而罐体夹套水温若仅作为控制手段、不直接影响CQA，则属于普通过程参数。NIR可测性评估的第一步，就是明确目标变量在CQA-CPP链条中的位置。
二、主要变量的近红外响应特性
NIR光谱来源于含氢基团（O-H、N-H、C-H、S-H）的倍频与合频振动吸收。水在NIR区有极强的O-H吸收，这既是生物过程NIR的难点，也是其能同时测量多种含水体系成分的基础。不同变量的响应强度、特异性和干扰程度差异很大，直接决定建模策略。
葡萄糖在1450–1600 nm与2100–2300 nm附近有C-H和O-H合频吸收，但水峰重叠严重，通常需要一阶或二阶导数预处理来分离。乳酸在1700–1750 nm附近有C=O伸缩合频，信号相对可辨，但在高浓度时易受pH解离状态影响。氨/铵根在NIR区响应较弱，主要依赖N-H合频，且与温度、pH相关，属于较难直接测量的变量。谷氨酰胺含酰胺基团，在2000–2200 nm有N-H与C=O组合吸收，但易与谷氨酸、天冬酰胺混淆。产物蛋白（如单抗）的响应来自肽键与侧链，信号强度随浓度增加，但在低浓度（<0.5 g/L）时容易被培养基背景掩盖。
下表给出典型变量在NIR可测性上的定性对比，供建模前筛选参考。表中数值为教学示例范围，实际项目需以本地光谱采集结果为准。
| 变量 | 主要吸收来源 | 典型光谱区（nm） | 响应强度 | 主要干扰 | 可测性等级 |
|---|---|---|---|---|---|
| 葡萄糖 | C-H、O-H合频 | 1450–1600、2100–2300 | 中 | 水峰、温度 | 高 |
| 乳酸 | C=O伸缩合频 | 1700–1750 | 中 | pH、离子强度 | 中高 |
| 氨/铵根 | N-H合频 | 2000–2200 | 弱 | pH、温度、水 | 中低 |
| 谷氨酰胺 | N-H、C=O组合 | 2000–2200 | 中弱 | 谷氨酸、天冬酰胺 | 中 |
| 产物蛋白 | 肽键、侧链C-H/N-H | 1500–1700、2050–2300 | 随浓度增加 | 培养基背景、细胞碎片 | 中高（高浓度） |
三、可测性评估方法：从光谱到模型的判断路径
可测性不是“能不能扫出光谱”，而是“光谱变化能否稳定、定量地对应目标变量”。评估应遵循一条可操作的路径：先做光谱采集与预处理，再做变量相关性分析，然后建立校正模型并验证，最后判断是否满足过程控制精度。下面给出一个可复用的评估流程，并以葡萄糖为例说明关键判断点。
- 采集设计：在工艺范围内设计至少5个浓度水平，每个水平3个重复，覆盖低、中、高及极端条件；同时记录温度、pH、搅拌等可能干扰量。
- 光谱预处理：对原始吸光度做SNV或MSC消除散射，再用一阶导数（Savitzky-Golay，窗口15点、二阶多项式）分离重叠峰。
- 相关性筛查：计算预处理后光谱与目标变量的相关系数，若在特征波段无显著相关（|r|<0.5），则直接判定可测性不足。
- 建模与验证：用偏最小二乘（PLS）建模，以留一法或独立验证集计算RMSEP与R²；葡萄糖示例目标为RMSEP<0.3 g/L、R²>0.9。
- 干扰检验：在温度±2°C、pH±0.2条件下重复预测，若预测偏差超过工艺允许误差的50%，则需引入温度或pH作为模型输入。
以葡萄糖为例，若在1450–1600 nm与2100–2300 nm波段经一阶导数处理后，PLS模型在独立验证集上得到RMSEP=0.22 g/L、R²=0.94，且温度扰动下偏差小于0.1 g/L，则可判定该条件下葡萄糖具备高可测性。反之，若氨的模型RMSEP达到0.5 mmol/L而工艺控制要求为0.2 mmol/L，则应考虑改用离子选择电极或酶法在线分析，而不是强行用NIR。
四、从可测性到过程控制：变量选择与模型维护
在实际项目中，CQA与CPP的NIR可测性评估应形成一张变量优先级表：高可测性且高工艺影响的变量优先上线；高可测性但影响小的变量可作为辅助监测；低可测性但关键的变量需保留参考方法并定期校准NIR模型。例如在单抗生产中，葡萄糖、乳酸、产物蛋白通常优先纳入NIR在线监测，而氨和谷氨酰胺可先做离线趋势验证，待模型稳定后再上线。
模型上线后还需维护。细胞培养批次间培养基批次差异、细胞株变化、补料策略调整都会导致光谱背景漂移。建议每批次采集至少3个离线参考样，用参考值与NIR预测值计算偏差；若连续3批偏差超过RMSEP的1.5倍，则触发模型更新。更新时优先扩充新条件下的样本，而不是简单重新拟合旧数据。
把上述关系落到工程实践，建议在项目启动阶段就建立一张“变量—可测性—控制需求”对照表，逐项填写目标变量、工艺允许误差、NIR候选波段、模型验证指标和替代方法。这样在后续建模、上线和维护时，团队对每个变量的定位都有据可依，避免把不可测的变量硬塞进NIR模型，也避免把可测且关键的变量遗漏在监测范围之外。