2. 近红外光谱基础
近红外（NIR）光谱分析之所以能用于生物过程检测，根源在于分子振动与光的相互作用。要真正读懂一张近红外光谱图，需要从分子振动的量子化本质出发，理解倍频与合频吸收的产生机制，明确近红外光谱区的划分，掌握朗伯-比尔定律及其在复杂体系中的偏离规律，并最终落到生物样品光谱特征这一实际对象上。
一、分子振动与倍频、合频吸收
分子中的化学键并非刚性连接，原子在平衡位置附近做周期性振动。以最简单的双原子分子为例，其振动可近似为简谐振子，振动频率由键的力常数 k 和折合质量 μ 决定：
ν = (1 / 2π) · √(k / μ)
其中：ν 为振动频率（Hz）
k 为化学键力常数（N/m），键越强 k 越大
μ 为折合质量，μ = m₁m₂ / (m₁ + m₂)在量子力学描述下，振动能量是量子化的，允许的能级为 E = (v + 1/2)hν，v = 0, 1, 2, …。当分子吸收光子能量恰好等于两能级之差时，发生振动跃迁。若跃迁发生在相邻能级之间（Δv = 1），称为基频吸收，对应中红外区；若跃迁发生在 Δv = 2、3 等更高能级之间，则称为倍频吸收，其频率近似为基频的整数倍，但实际因非谐性会略小于整数倍。
多原子分子中，不同振动模式之间可以发生耦合，当光子能量等于两个或多个基频振动能量之和时，产生合频吸收。例如，一个 C—H 伸缩振动（约 2900 cm⁻¹）与一个 C—H 弯曲振动（约 1450 cm⁻¹）的合频吸收出现在约 4350 cm⁻¹ 附近。倍频与合频吸收的共同特点是：跃迁概率低，摩尔吸光系数小，因此近红外光谱的吸光度通常比中红外弱 1～3 个数量级，这既是近红外分析需要较长光程或较高浓度的原因，也使其对高浓度、强吸收的含水生物样品具有天然适配性。
二、近红外光谱区划分
近红外区通常定义为波长 780～2526 nm，对应波数 12800～4000 cm⁻¹，介于可见光与中红外之间。按波长可进一步划分为三个子区：短波近红外（SW-NIR，780～1100 nm）、中波近红外（1100～1800 nm）和长波近红外（LW-NIR，1800～2526 nm）。短波区以高倍频（Δv = 3～4）和电子跃迁为主，吸收弱、穿透深，适合厚样品透射测量；长波区以低倍频（Δv = 2）和合频为主，吸收较强、信息丰富，但穿透浅，更适合漫反射或短光程透射。生物过程分析中，发酵液、细胞培养液等含水体系常选用短波区透射，而固体或高浓度样品则多用长波区漫反射。
三、朗伯-比尔定律及其偏离
朗伯-比尔定律是近红外定量分析的基石，其数学表达为：
A = ε · c · l = -lg(I / I₀)
其中：A 为吸光度（无量纲）
ε 为摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹）
c 为吸光物质浓度（mol/L）
l 为光程（cm）
I₀ 为入射光强度，I 为透射光强度该定律成立需满足三个前提：入射光为单色光、吸光物质间无相互作用、体系均匀且无散射。然而生物样品几乎无法同时满足这些条件。实际中常见的偏离包括：
- 化学偏离：高浓度下溶质分子间发生缔合、氢键重组，ε 随浓度变化，A 与 c 不再线性。例如蛋白质浓度超过约 50 g/L 时，其酰胺基团近红外吸收出现明显非线性。
- 物理偏离：样品颗粒散射、折射率不匹配导致光程不确定，尤其对细胞悬液、固体培养基等非均相体系影响显著。
- 仪器偏离：光谱带宽不足、杂散光、基线漂移等使实际测量偏离理想模型。
因此，近红外定量很少直接套用朗伯-比尔定律，而是借助多元校正方法（如偏最小二乘回归 PLS）建立光谱与浓度的经验模型，将非线性与散射效应纳入校正过程。
四、生物样品近红外光谱特征
生物样品（发酵液、细胞培养液、组织匀浆等）的近红外光谱具有以下典型特征：
- 水的主导吸收：水在 1450 nm（O—H 一级倍频）和 1940 nm（O—H 合频）附近有强吸收带，含水样品在这些区域常出现吸光度饱和，需避开或采用短波区。
- 多组分叠加：蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸等组分的 C—H、O—H、N—H 吸收带相互重叠，形成宽而平滑的包络光谱，单波长信息有限，必须依靠多波长建模。
- 散射与基线漂移：细胞、颗粒物引起散射，使基线抬升或倾斜，需通过多元散射校正（MSC）、标准正态变量变换（SNV）等预处理消除。
- 动态变化：生物过程进行中，底物消耗、产物积累、细胞生长导致光谱随时间连续变化，为在线监测提供了依据，但也要求模型具备时变适应性。
综上，近红外光谱分析在生物过程中的应用，本质上是利用分子振动倍频与合频吸收携带的组成信息，在明确光谱区划分与定律适用边界的前提下，针对生物样品水强吸收、多组分叠加、散射显著的特点，通过预处理与多元校正提取有效信号，实现浓度、细胞量等关键参数的快速估计。