📚 课程目录第2章补料分批发酵的物料衡算与化学计量学

2. 补料分批发酵的物料衡算与化学计量学

补料分批发酵与普通分批发酵最大的区别，在于反应器内物料总量随时间变化：底物被连续或间歇补入，体积不断增大，而产物、菌体、副产物同时累积。因此，物料衡算不能只做“初始—终点”两点核算，而必须建立随时间变化的微分衡算框架。本节围绕得率系数、维持系数、产物生成动力学、碳氮源平衡与副产物估算五个核心问题展开，目标是让读者能够用一套可计算的化学计量关系，把补料策略与产量、副产物、氮源需求定量地联系起来。

一、补料分批发酵的通用物料衡算框架

对反应器内任一组分 i，其动态衡算可写成：

d(V·Ci)/dt = F·Ci,in − F·Ci,out + V·ri

其中 V 为发酵液体积（L），Ci 为组分 i 的浓度（g/L），F 为补料流加速率（L/h），Ci,in 为补料液中 i 的浓度，ri 为体积比反应速率（g/(L·h)）。补料分批通常无出料，故 Ci,out = 0。展开左侧导数可得：

V·dCi/dt = F·(Ci,in − Ci) + V·ri

这一形式说明：某组分浓度的变化由“稀释效应”和“生物合成/消耗”两部分叠加。当补料液不含该组分（如补糖时氮源不再补入），则 Ci,in = 0，稀释项为 −F·Ci/V，即稀释速率 D = F/V。理解这一点是后续所有得率与维持系数计算的基础。

二、得率系数：从表观得率到真实得率

得率系数描述底物转化为菌体或产物的效率。常用定义包括：

菌体对底物得率 Y_X/S = ΔX/ΔS（g 菌体/g 底物）；
产物对底物得率 Y_P/S = ΔP/ΔS（g 产物/g 底物）；
产物对菌体得率 Y_P/X = ΔP/ΔX（g 产物/g 菌体）；
氧得率 Y_X/O = ΔX/ΔO₂（g 菌体/g 氧）。

在补料分批中，直接用“终点减初始”计算的是表观得率，它把维持消耗、副产物消耗和补料带入的底物全部混在一起。要得到真实得率，需扣除维持项。经典做法是采用 Pirt 双项模型：

qS = μ / YX/S,max + mS

其中 qS 为比底物消耗速率（g 底物/(g 菌体·h)），μ 为比生长速率（1/h），Y_X/S,max 为最大（真实）菌体得率，mS 为维持系数（g 底物/(g 菌体·h)）。将上式两边同除以 μ，得到线性形式：

qS/μ = 1/YX/S,max + mS/μ

以 1/μ 为横坐标、qS/μ 为纵坐标作图，截距即 1/Y_X/S,max，斜率即 mS。这是从恒化器或拟稳态补料分批数据中提取真实得率与维持系数的标准方法。

三、维持系数与能量衡算

维持系数 mS 反映菌体在不生长时仍消耗底物用于维持渗透压、修复大分子、维持膜电位等。其量级通常为 0.01～0.1 g 底物/(g 菌体·h)，但在高密度补料后期，维持消耗可占总耗糖的 20%～40%。若忽略维持项，会高估得率、低估补糖量，导致后期碳源不足或代谢副产物积累。

工程上常用“维持系数×菌体总量×时间”估算维持耗糖：

维持耗糖 ≈ mS × ∫X·V dt

例如某重组大肠杆菌高密度发酵，菌体干重最终 80 g/L，发酵 30 h，平均菌体量约 40 g/L，mS 取 0.04 g/(g·h)，则维持耗糖约 0.04×40×30 = 48 g/L，相当于总耗糖的相当一部分，必须在补料配方中预留。

四、产物生成动力学：生长偶联、部分偶联与非偶联

产物生成与菌体生长的关系决定补料策略。常用 Luedeking–Piret 方程描述：

qP = α·μ + β

其中 qP 为比产物生成速率，α 为生长偶联系数，β 为非生长偶联系数。三种典型情形：

生长偶联型（β≈0）：产物随菌体生长同步形成，如某些初级代谢产物；补料应维持较高 μ。
非生长偶联型（α≈0）：产物主要在菌体生长停止后形成，如青霉素、部分次级代谢产物；应采用“先长菌、后产素”的两阶段补料。
部分偶联型（α、β均不为零）：两者兼有，需在产率与比生长速率之间取平衡。

在补料分批中，若已知 α、β，可由目标 μ 反推所需补料速率，使 qP 达到最大而不触发副产物积累。

五、碳氮源平衡与副产物估算

碳氮源平衡的核心是：补入的碳源一部分用于菌体合成，一部分用于产物，一部分用于维持，剩余部分可能以 CO₂、有机酸、醇等副产物形式流失。以葡萄糖为碳源、氨水为氮源时，可写出简化元素衡算：

C6H12O6 + a O2 + b NH3 → c CH1.8O0.5N0.2 + d CO2 + e H2O + f 副产物

通过测定补糖总量、菌体干重、产物量、耗氧量和 CO₂ 释放量，可反推碳回收率：

碳回收率 = (菌体碳 + 产物碳 + CO2碳) / 补入碳源碳 × 100%

若碳回收率明显低于 90%，说明有未计量的副产物（如乙酸、乳酸、乙醇）积累。乙酸是重组大肠杆菌补料分批中最常见的副产物，当比生长速率超过临界值或葡萄糖局部过量时，乙酸生成速率上升。工程上常以“乙酸 < 2 g/L”作为补料速率上限的判据，并通过降低补料速率或改用甘油/葡萄糖混合补料来控制。

实操建议：在补料分批中，每 2～4 h 取样测定残糖、乙酸、氨氮和菌体 OD，用残糖“不累积、不耗尽”作为补料速率是否匹配的快速判据。残糖持续上升说明补料过快，残糖降至零且乙酸上升说明补料不足或代谢转向。

六、化学计量学在补料策略中的落地

把上述关系串起来，可形成一套可执行的补料计算流程：先由目标菌体量和真实得率估算总糖需求，再加上维持耗糖和产物耗糖，得到总补糖量；再根据临界比生长速率和反应器体积，确定补料速率曲线；最后用碳回收率和乙酸浓度在线校验。例如，目标菌体 60 g/L，Y_X/S,max = 0.5 g/g，维持耗糖 20 g/L，产物耗糖 10 g/L，则总糖需求约 60/0.5 + 20 + 10 = 150 g/L。若发酵 25 h，平均补料速率约 6 g/(L·h)，再按指数—恒速—衰减三段分配，即可得到一条可操作的补料曲线。

综上，补料分批的物料衡算不是单一公式，而是一组相互耦合的关系：体积变化决定稀释速率，稀释速率影响浓度动态，浓度动态又反过来约束得率、维持和产物生成。把得率系数、维持系数、Luedeking–Piret 方程和碳氮平衡放在同一框架下计算，才能让补料曲线既有理论依据，又能在残糖、乙酸、氨氮等在线信号上得到验证。