4. SDS-PAGE凝胶配制工程

SDS-PAGE的分离能力，本质上由凝胶的“孔径梯度”决定。分离胶负责按分子量大小筛分蛋白，浓缩胶负责把样品压成一条极窄的起始带。配胶不是简单地把几种液体混在一起，而是在设计一个可控的聚合物网络：丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例决定交联密度，总浓度决定平均孔径，引发体系决定聚合速度与均匀性，凝胶厚度与梳齿则决定上样量和条带形态。理解这四者的耦合关系，才能把“胶”从耗材变成可调参数。

一、分离胶与浓缩胶的分工与配方设计

分离胶的孔径必须与目标蛋白分子量匹配。常用经验是：目标蛋白在30–100 kDa，选12%分离胶；10–40 kDa选15%；40–150 kDa选10%；150 kDa以上选6%–8%。这里的百分比是丙烯酰胺与双丙烯酰胺的总质量体积分数（w/v）。总浓度越高，孔径越小，小蛋白分辨越好，但大蛋白可能被完全排阻而无法进入胶内。

交联剂比例同样关键。标准配方中丙烯酰胺:双丙烯酰胺为29:1（质量比），对应交联度约3.3%。若目标蛋白分子量较大，可改用37.5:1降低交联度、增大孔径；若需要更致密的网络，可提高至19:1。注意：双丙烯酰胺比例过高会导致胶变脆、易开裂，且疏水性增强，条带拖尾风险上升。

浓缩胶通常固定为4%–5%，pH 6.8， Tris-HCl缓冲。它的作用不是分离，而是利用甘氨酸-氯离子不连续缓冲体系，在样品进入分离胶前形成高电场区，把蛋白压缩成薄带。浓缩胶过高（如8%）会降低压缩效率，过低（如3%）则机械强度不足，梳齿易变形。

配方设计顺序建议：先定目标蛋白分子量范围 → 选分离胶浓度 → 确认交联比 → 再定浓缩胶浓度与体积。不要先配胶再想分离什么。

二、丙烯酰胺聚合控制：从自由基到网络

SDS-PAGE凝胶是自由基引发的链式聚合。过硫酸铵（APS）提供引发自由基，TEMED催化APS分解并加速自由基生成。聚合速度受四个因素控制：APS浓度、TEMED浓度、温度、以及溶液中氧气含量。

典型配方中，10%分离胶每10 mL加入10% APS 100 μL和TEMED 4–10 μL。APS过多会导致聚合过快，凝胶内部产生应力与气泡；APS过少则聚合不完全，胶软、条带弥散。TEMED过多会使胶在灌制过程中提前凝固，造成界面不平；TEMED过少则聚合时间过长，丙烯酰胺单体残留增加，毒性风险上升。

温度是常被忽视的变量。室温25℃时聚合约15–20分钟；若室温低于18℃，聚合可能延长至40分钟以上，此时应适当增加APS或TEMED，或将配胶环境预热至25–30℃。但温度超过35℃会加速聚合，导致凝胶不均匀，出现“波浪状”条带。

氧气是自由基清除剂。灌胶后必须用无水乙醇或水饱和正丁醇封液面，隔绝氧气并压平界面。封液层厚度约5 mm，静置至胶完全聚合（可见明显折射线）。若封液后界面仍不平，通常是封液操作过慢或胶已开始聚合。

丙烯酰胺单体具有神经毒性，配胶全程应戴手套、在通风柜内操作。聚合不完全的胶中残留单体浓度更高，废弃胶应按化学废物处理，不可直接丢弃。

三、凝胶厚度与梳齿选择

凝胶厚度由玻璃板间隔条决定，常见规格为0.75 mm、1.0 mm、1.5 mm。厚度选择取决于上样量与目标蛋白丰度：

  • 0.75 mm：适合高丰度蛋白、银染或放射性检测，条带锐利，但上样量通常不超过15 μL/孔。
  • 1.0 mm：最通用，上样量20–30 μL/孔，兼顾分辨率与载量，适合大多数Western Blot。
  • 1.5 mm：适合低丰度蛋白或需要大量上样（40–60 μL/孔），但染色和转膜时间需延长，条带略宽。

梳齿选择同样影响结果。10孔梳齿适合常规比较，15孔梳齿适合多条件筛选，但每孔宽度变窄，上样量下降。梳齿厚度必须与间隔条匹配：0.75 mm梳齿插入1.0 mm胶中会因密封不严导致漏胶，反之则难以插入且易损坏胶面。梳齿齿尖应平整、无倒钩，插入时保持垂直，避免产生气泡。

拔梳齿的时机是另一个关键点。应在浓缩胶完全聚合后、但未过度干燥前拔出。拔齿时双手同时均匀用力，垂直向上，避免左右晃动撕裂加样孔。若孔内有残留胶屑，用注射器针头或移液器轻轻冲洗，但不要刮擦孔壁。

四、配胶流程与关键判断

以下给出一个可执行的12%分离胶+4%浓缩胶配制示例（1.0 mm厚，10孔梳齿，两块胶用量）：

12%分离胶（10 mL，两块胶）：
  ddH2O            3.3 mL
  30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(29:1)  4.0 mL
  1.5 M Tris-HCl pH 8.8        2.5 mL
  10% SDS           100 μL
  10% APS           100 μL
  TEMED             4 μL

4%浓缩胶（5 mL，两块胶）：
  ddH2O            3.05 mL
  30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(29:1)  0.65 mL
  1.0 M Tris-HCl pH 6.8        1.25 mL
  10% SDS            50 μL
  10% APS            50 μL
  TEMED              5 μL

操作顺序：装板→配分离胶→灌胶至距短板上沿约1.5 cm→封液→聚合15–20 min→倒去封液→配浓缩胶→灌满→插梳齿→聚合15 min→拔齿→冲洗孔→上样。

判断聚合是否完成，可观察封液层与胶面之间是否出现清晰折射线，或倾斜胶板时胶是否整体不动。若30分钟后仍未见折射线，应检查APS是否失效（APS易吸潮分解，建议每月新配10%母液）或TEMED是否过期。

SDS-PAGE凝胶结构与关键参数 浓缩胶 4% pH 6.8 · Tris-HCl 压缩样品成薄带 分离胶 12% pH 8.8 · Tris-HCl 按分子量筛分 梳齿（10孔） 孔 孔 孔 孔 孔 孔 浓缩胶层 高度约 1.5 cm 4% T, 3.3% C 分离胶层 12% T, 3.3% C 孔径随浓度升高而减小 凝胶厚度 0.75 / 1.0 / 1.5 mm 聚合控制四要素 APS 浓度 TEMED 浓度 温度 25℃ 氧气隔绝 封液：无水乙醇/水饱和正丁醇 聚合时间：15–20 min（25℃） 分离胶浓度选择参考 6% 150–300 kDa 10% 40–150 kDa 12% 30–100 kDa（常用） 15% 10–40 kDa

配胶完成后，建议在胶板外侧标记分离胶浓度、配制日期与操作人。胶可在4℃湿润环境中保存1–2天，但浓缩胶最好当天现配。若胶面出现干缩、气泡或与玻璃板剥离，应弃用重配。把配胶当作一次小型聚合反应来管理，后续电泳的条带质量才有稳定基础。

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