2. 样本制备工程
Western Blot 的信号强弱，在抗体孵育之前就已经被样本制备决定了上限。裂解不充分、抑制剂失效或提取效率偏低，都会让后续封闭、孵育、显影的努力变成对低质量裂解液的“过度解读”。本节把样本制备当作一项可量化、可复现的工程任务来处理：先选裂解策略，再配抑制剂，最后用可观察指标评估提取效率。
一、裂解策略：先看样本形态，再选裂解方式
裂解的核心目标是把目标蛋白从细胞或组织中以天然构象或变性状态尽可能完整地释放到溶液中，同时避免降解与修饰丢失。常用策略可分为三类：
- 温和裂解（非变性）：使用 NP-40、Triton X-100 等非离子去垢剂，适合免疫共沉淀、酶活检测，但膜蛋白与核蛋白释放有限。
- 中等强度裂解：RIPA 缓冲液（含 SDS、脱氧胆酸钠）兼顾溶解性与蛋白完整性，是 Western Blot 最常用的通用方案。
- 强变性裂解：SDS 裂解液或尿素/硫脲体系，适合难溶蛋白、核基质蛋白，但会破坏蛋白相互作用。
对于培养细胞，贴壁细胞先用预冷 PBS 洗去培养基（血清蛋白会干扰 BCA 定量），再直接加裂解液刮取；悬浮细胞则离心收集后重悬裂解。对于组织样本，必须先在液氮中研磨或使用钢珠匀浆，避免直接投入裂解液导致外层蛋白被固定而内层未裂解。一个可参考的示例参数是：每 10 mg 组织加 100 μL RIPA，冰上裂解 30 min，每 10 min 涡旋 10 s；细胞则按 6 孔板每孔 100–150 μL 裂解液计算。
二、蛋白酶与磷酸酶抑制剂：按目标修饰选择
裂解一旦开始，内源性蛋白酶和磷酸酶就同时被释放。蛋白酶抑制剂通常使用广谱鸡尾酒，覆盖丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶；磷酸酶抑制剂则需根据目标蛋白的磷酸化类型选择：
| 抑制剂 | 主要抑制对象 | 典型工作浓度 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| PMSF | 丝氨酸蛋白酶 | 1 mM | 通用裂解，需现用现加 |
| Leupeptin | 丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶 | 1–10 μg/mL | 与 PMSF 互补 |
| Na₃VO₄ | 酪氨酸磷酸酶 | 1 mM | 检测 p-Tyr |
| NaF | 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 | 10–50 mM | 检测 p-Ser/p-Thr |
| β-甘油磷酸钠 | 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 | 10–20 mM | 与 NaF 联用 |
关键操作细节：PMSF 在水溶液中半衰期仅约 30 min，必须在裂解前现用现加；Na₃VO₄ 需先活化（煮沸后调 pH），否则抑制效率显著下降。若目标蛋白是磷酸化蛋白，建议在裂解液中同时加入 NaF、β-甘油磷酸钠和 Na₃VO₄，并在冰上操作、避免反复冻融。
三、提取效率评估：用数据判断“裂解够不够”
提取效率不能靠“看起来浑浊”判断，而应通过蛋白浓度、目标蛋白信号、残留沉淀三个层面评估。常用流程如下：
- 裂解后 12,000–14,000 × g、4 ℃ 离心 15 min，取上清。
- BCA 或 Bradford 法测定上清总蛋白浓度，记录每毫克组织的蛋白得率。
- 取等量上清进行 SDS-PAGE，用目标蛋白抗体检测信号强度。
- 观察离心后沉淀量：若沉淀明显且目标蛋白信号弱，说明裂解不充分或蛋白难溶。
一个合理的示例判断标准是：培养细胞裂解液浓度通常在 1–5 mg/mL，组织裂解液在 2–10 mg/mL；若低于 1 mg/mL，需检查裂解液体积、裂解时间或匀浆是否充分。若目标蛋白在沉淀中仍可检出，可尝试增加 SDS 浓度或改用尿素裂解液。
四、可复现的样本制备记录要点
为了让不同批次、不同操作者之间可比较，建议在实验记录中固定以下字段：样本类型与重量/细胞数、裂解液种类与体积、抑制剂批号与加入时间、裂解温度与时长、离心条件、上清体积、BCA 浓度、上样量。若目标蛋白为磷酸化蛋白，还应记录从收样到加入裂解液的间隔时间——这个时间越长，磷酸酶作用越充分，信号损失越难追溯。
样本制备的工程化判断标准可以归纳为一句话：裂解要彻底、抑制要及时、评估要有数。当 BCA 浓度落在合理区间、目标条带清晰、沉淀量可控时，后续 Western Blot 的变量才真正收敛到抗体与显影环节。