📚 课程目录第3章蛋白定量与标准化

3. 蛋白定量与标准化

Western Blot 的信号强弱，本质上取决于每个泳道里“真正进入凝胶的目标蛋白分子数”。如果各泳道上样体积相同，但裂解液浓度相差两倍，那么条带深浅的差异就与生物学变化无关，而只是加样误差。因此，蛋白定量与标准化是 WB 实验中最容易被忽视、却最影响结论可信度的一步。本节围绕三个问题展开：用什么方法定量、如何把浓度换算成实际上样体积、以及用什么内参来证明“每个泳道加得一样多”。

一、三种经典定量方法的原理与取舍

BCA、Bradford、Lowry 都属于“显色法”，即通过化学反应把蛋白浓度转换成可测的吸光度，再用标准曲线反推浓度。它们的差别在于反应基团、显色产物和干扰物谱。

BCA（二喹啉甲酸法）基于双缩脲反应：蛋白在碱性条件下将 Cu²⁺ 还原为 Cu⁺，Cu⁺ 再与两分子 BCA 螯合，形成紫色复合物，在 562 nm 有最大吸收。它的优点是兼容 0.1%–1% 的常见去垢剂（如 Triton X-100、NP-40、SDS），线性范围较宽，适合 RIPA 裂解液体系。缺点是显色反应依赖温度和时间，且对还原剂（DTT、β-巯基乙醇）和螯合剂（EDTA）敏感。

Bradford（考马斯亮蓝法）利用考马斯亮蓝 G-250 在酸性条件下与蛋白的碱性氨基酸（主要是精氨酸）和芳香族残基结合，染料由红色阳离子型转为蓝色阴离子型，595 nm 吸光度上升。它快速、灵敏，但线性范围窄，且对去垢剂（尤其 SDS）和碱性缓冲液极其敏感，不同蛋白之间因氨基酸组成差异会产生明显的“蛋白间偏差”。

Lowry 法是 BCA 的前身，结合了双缩脲反应与 Folin-酚试剂还原，灵敏度高，但步骤多、耗时、对多种试剂干扰敏感，目前多被 BCA 取代。

选择原则：裂解液含去垢剂时优先 BCA；样品极稀、需要高灵敏度且体系干净时可考虑 Bradford；Lowry 仅在特定历史数据可比时使用。无论哪种方法，都必须用与样品相同的缓冲液配制标准品，否则缓冲液本身会贡献背景。

二、标准曲线的制作要点

标准曲线不是“画一条线”那么简单，它决定了后续所有浓度换算的准确度。以 BCA 为例，推荐操作如下：用与样品完全相同的裂解液将 BSA 标准品（通常 2 mg/mL）梯度稀释为 0、25、50、100、200、400、600、800、1000 μg/mL，每个浓度做复孔。加入 BCA 工作液后 37 ℃ 孵育 30 min，冷却至室温，在 562 nm 读取吸光度。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标做线性回归，要求 R² ≥ 0.99。

关键细节有三点：第一，标准品的稀释液必须与样品缓冲液一致，否则裂解液中的去垢剂、还原剂会改变显色斜率；第二，样品的吸光度必须落在标准曲线范围内，若超出上限需稀释后重测，若低于最低点则说明样品过稀，应浓缩或改用更灵敏的方法；第三，每次实验都要重新做标准曲线，因为显色反应受温度、时间、试剂批次影响，不能沿用旧曲线。

三、从浓度到上样体积

定量完成后，下一步是把“浓度”翻译成“上样体积”。假设测得某组样品浓度为 3.2 μg/μL，目标上样量为 30 μg，则所需体积为 30 ÷ 3.2 ≈ 9.4 μL。若各组浓度不同，应先用裂解液把所有样品稀释到同一浓度（例如统一稀释到 2 μg/μL），再取相同体积上样，这样比“逐管计算体积”更不容易出错。

实际操作中，通常还会加入 4× 或 5× 上样缓冲液，并补加裂解液使各管终体积一致。例如目标终体积 20 μL，样品体积 10 μL，则加入 4 μL 4× buffer 和 6 μL 裂解液。上样前 95–100 ℃ 变性 5–10 min，短暂离心后取全部或定量体积上样。

常见错误：只测一次浓度就用于所有后续实验；用不同缓冲液配标准品；样品吸光度超出标准曲线上限却直接外推；上样体积差异过大导致泳道间盐浓度和去垢剂浓度不同，影响电泳迁移。

四、内参选择：证明“加得一样多”

内参（loading control）的作用是监控上样量、转膜效率和显色均匀性。理想内参应在所有样本中表达稳定，且分子量与目标蛋白有明显差异，便于在同一张膜上区分。常用内参包括：

β-actin（约 42 kDa）：表达丰富，抗体便宜，适合大多数组织与细胞；但在某些细胞中表达会随处理变化。
GAPDH（约 37 kDa）：同样常用，但受糖代谢、缺氧等条件影响，且与部分目标蛋白分子量接近。
β-tubulin（约 55 kDa）：适合与 40 kDa 以下目标蛋白搭配。
Vinculin（约 117 kDa）或 Lamin B1（约 68 kDa）：适合大分子目标蛋白或核蛋白样本。

选择内参时，应优先考虑“目标蛋白分子量 + 内参分子量”能否在凝胶上清晰分开。例如目标蛋白约 40 kDa，就不宜选 GAPDH（37 kDa），否则条带容易重叠；此时可换用 β-actin（42 kDa）或 β-tubulin（55 kDa）。此外，若处理条件可能影响内参表达，应同时使用两个内参互相验证，或改用总蛋白染色（如 Ponceau S、Stain-Free）作为补充证据。

五、标准化流程小结

把上述步骤串起来，一个可复现的标准化流程是：裂解后立即冰上操作，BCA 定量并记录浓度；根据目标上样量计算体积，用裂解液统一稀释到相同浓度；加入上样缓冲液并变性；上样前再次短暂离心；电泳后先检测内参，确认各泳道内参条带灰度差异在 ±20% 以内，再分析目标蛋白。若内参本身差异过大，说明上样或转膜存在问题，此时目标蛋白的定量结果不可信，应重新制样或重新转膜。

蛋白定量与标准化并不产生“漂亮的结果图”，但它决定了结果图是否可信。把标准曲线做扎实、把上样体积算清楚、把内参选对，后续的显影和灰度分析才有意义。