📚 课程目录第4章 RNA完整性检测

4. RNA完整性检测

RNA完整性是RNA-seq文库构建中最先决定成败的质控关口。提取到的总RNA若发生降解，rRNA峰会被低分子量弥散信号取代，mRNA的完整比例随之下降，后续oligo(dT)富集或rRNA去除都会偏向短片段，最终表现为5′端覆盖度下降、3′端堆积、基因检出数减少。因此，在进入文库构建前，必须用可量化的方法判断RNA是否“够完整”。

三种检测手段的定位差异

凝胶电泳是最传统的方法：变性琼脂糖凝胶中，完整真核总RNA应呈现两条清晰的rRNA主带（28S与18S），28S亮度约为18S的1.5～2倍，且两者之间及主带上方无明显弥散。它的优点是直观、成本低，缺点是分辨率有限、无法给出标准化数值、对轻微降解不敏感，且上样量、染色和拍照条件都会影响判读。

Agilent Bioanalyzer基于芯片式毛细管电泳，样品在微通道中按分子量分离，激光诱导荧光检测得到电泳图（electropherogram）和虚拟凝胶图。它灵敏度高、所需样品量少（约1～5 ng总RNA即可），并自动计算RIN（RNA Integrity Number）。TapeStation采用类似的微流控电泳原理，配合ScreenTape，通量更高、操作更简便，输出RIN^e（RNA Integrity Number equivalent）与DV200。三者并非互相替代，而是精度、通量与成本之间的取舍：凝胶电泳适合快速初筛，Bioanalyzer适合少量珍贵样品的精细评估，TapeStation适合批量样本的标准化质控。

RIN算法：它到底在算什么

RIN不是简单的28S/18S比值，而是对整条电泳图进行多特征建模后给出的1～10分。算法会提取区域峰高、峰面积、28S与18S峰的位置和宽度、两峰之间的弥散程度、低分子量区域的信号占比等特征，再通过已训练的分类模型映射为完整性分数。因此，RIN对28S/18S比例变化非常敏感，但它的“盲区”在于：它主要描述rRNA的状态，而rRNA完整并不等于mRNA完整。某些组织（如胰腺、肝脏）本身rRNA结构特殊，或提取过程中rRNA被部分去除，都可能出现RIN偏低但mRNA仍可用的情形。

RIN的判读通常遵循以下经验区间：RIN≥8为高质量，适合常规poly(A)建库；RIN 6～7为可接受，但需关注3′偏倚；RIN<6时，若仍要建库，应改用DV200作为主要决策指标。需要强调的是，RIN是样本层面的整体评分，不能替代对电泳图形态的人工复核——例如出现异常尖峰、基线漂移或“假28S峰”时，RIN可能被高估或低估。

DV200：降解样本的建库通行证

DV200（Percentage of RNA fragments >200 nucleotides）由TapeStation或Bioanalyzer的smear分析给出，定义为大于200 nt的RNA片段占总RNA信号的百分比。它直接对应文库构建中可被逆转录和接头连接的片段比例，因此对FFPE样本、降解组织或微量样本尤其有价值。常见判读为：DV200≥70%为优质；50%～70%可建库，但需增加起始量或调整片段化时间；30%～50%属于高风险，建议使用专门针对降解RNA的建库试剂盒；DV200<30%通常不建议继续，除非样本极其珍贵且接受数据质量下降。

一个实用的组合策略是：先看RIN，RIN≥8直接进入建库；RIN<8时看DV200，DV200≥50%仍可建库，但应在文库质控中重点检查插入片段分布和5′/3′覆盖均匀性。对于FFPE样本，RIN往往很低甚至无法计算，此时DV200是唯一可靠的决策依据。

常见异常图谱与排查方向

实际检测中，电泳图常出现几类典型异常。第一类是“28S峰缺失、18S峰突出”，常见于RNA已明显降解，也可能是某些物种28S rRNA发生“隐性断裂”（hidden break），在变性条件下28S会裂解为两个片段，导致28S峰消失但样本并未降解。第二类是“基线整体抬高、主带模糊”，多与样品中残留的酚、胍盐、乙醇或高浓度盐有关，会抑制电泳分离和荧光标记，此时应重新纯化（如乙醇沉淀或柱纯化）后再检测。第三类是“出现高分子量肩峰或额外尖峰”，可能来自基因组DNA污染，需用DNase I消化后复检。第四类是“峰形正常但RIN异常低”，需检查是否上样量过低、毛细管堵塞或试剂过期，建议用标准品（如Agilent RNA 6000 Nano Ladder）验证系统状态。

对于珍贵或微量样本，建议先用TapeStation或Bioanalyzer检测，保留剩余样品用于建库；凝胶电泳可作为快速初筛，但不宜作为唯一判据。若样本量极少，可考虑使用高灵敏度试剂（如RNA 6000 Pico）以降低上样需求。

RIN与DV200都不是绝对阈值，而是风险提示。RIN低但DV200高的样本仍可能产出可用数据，但需要在建库前与实验目的、样本来源和预期数据质量之间做权衡，并在报告中明确记录所用判据。

可执行的质控记录示例

为保证结果可追溯，建议在样本登记表中记录以下字段（示例格式，实际数值需以真实检测为准）：

样本编号	检测方法	RIN/RIN^e	DV200	28S/18S	图谱备注	建库决策
S-001	TapeStation	9.2	—	1.9	两主带清晰	常规建库
S-002	Bioanalyzer	6.8	—	1.1	基线轻度抬高	建库，关注3′偏倚
S-003	TapeStation	2.5	58%	—	主带消失，弥散	降解专用建库
S-004	凝胶电泳	—	—	≈1.0	28S弱，疑似降解	复检后决策

记录时需注意：RIN与RIN^e来自不同平台，数值不可直接混用比较；DV200仅在部分平台和软件版本中输出；凝胶电泳的28S/18S比值应通过凝胶成像定量，而非目测。只有把检测方法、数值、图谱形态和最终建库决策绑定在一起，质控记录才真正具备回溯价值。