2. RNA样本采集与保存
RNA与DNA最大的不同在于其化学稳定性极差。RNA的核糖2′位带有羟基，使其在碱性条件下极易发生自水解；同时环境中无处不在的RNase（RNA酶）活性极高、耐热、耐酸碱，且难以通过常规灭菌彻底灭活。因此，从样本离体那一刻起，RNA就开始降解。RNA-seq文库能否真实反映转录组，很大程度上取决于采样与保存环节是否把“降解”控制在可接受范围内。本节围绕不同样本类型的采集规范、保存液选择、降解风险识别与现场操作要点展开。
一、先理解降解的两个来源
RNA降解主要来自两条路径。其一是内源酶降解：细胞破裂或组织缺血后，溶酶体释放的RNase以及细胞质中的RNase被激活，从内部切割RNA。其二是外源酶污染：皮肤、唾液、灰尘、未清洁的器械、非无RNase耗材带入的RNase，从外部攻击样本。现场操作的核心目标就是同时压制这两条路径——快速灭活内源酶，并严格阻断外源酶引入。
降解程度通常用RIN值（RNA Integrity Number，0～10）或DV200（大于200 nt的RNA片段占比）衡量。RIN≥7通常满足常规mRNA-seq建库；RIN在5～7之间可用于部分建库但需增加投入量；RIN<5时，poly(A)富集法建库会严重偏向3′端，此时应改用rRNA去除法或考虑样本已不可用。DV200在降解样本中比RIN更稳健，DV200≥30%仍有一定建库价值。
二、不同样本类型的采集规范
1. 培养细胞。贴壁细胞弃培养基后，用预冷PBS轻洗一次，直接加裂解液（如TRIzol或柱式裂解缓冲液）覆盖，用移液器反复吹打至无可见细胞团，转入无RNase离心管。悬浮细胞则离心（300×g，4℃，5 min）弃上清，PBS重悬洗涤一次后再裂解。关键点是洗涤后尽量吸干残余PBS，否则稀释裂解液会降低提取效率。
2. 动物组织。离体后应在1～3分钟内切成≤5 mm×5 mm×5 mm的小块，立即投入液氮速冻或RNA保存液。整块组织直接冷冻会导致内部降温缓慢，中心区域RNA在冻结前已开始降解。对于肝脏、胰腺等高RNase活性组织，速度要求更严。取样器械应每样本更换或经RNase去除处理。
3. 植物组织。植物细胞壁厚、次生代谢物多（多酚、多糖），采集后同样需液氮速冻。富含多酚的组织可在裂解液中加入β-巯基乙醇或PVP。采样应避开衰老叶片，优先取幼嫩部位。
4. 血液。这是最易出问题的样本类型。全血中的白细胞在离体后转录谱会迅速改变，且红细胞中的血红蛋白会抑制后续酶反应。推荐使用EDTA抗凝管（避免肝素，肝素抑制逆转录酶），采集后尽快加入RNA保存液（如PAXgene Blood RNA Tube），室温稳定数小时至数天。若需分离PBMC，应在采集后2小时内完成Ficoll分离。
5. 体液与微量样本。血清、血浆、尿液、脑脊液等游离RNA样本，需低温离心去除细胞碎片后分装冻存。微量样本（如穿刺组织、单细胞）应尽量减少操作步骤，避免反复冻融。
三、保存液与保存条件的选择
保存方案可归纳为三类：液氮/超低温冷冻、RNA保存液、直接裂解。液氮速冻适合组织，能瞬间灭活酶活性，但需-80℃长期保存且避免反复冻融。RNA保存液（如RNAlater、PAXgene）通过高浓度盐或变性剂使RNase失活，可在室温或4℃短期稳定样本，适合现场采样和运输。直接裂解（如TRIzol）适合细胞和少量组织，裂解后RNA在-20℃可稳定数周。
选择时需权衡：现场条件是否具备液氮或干冰？运输时间多长？下游建库方法对保存液残留是否敏感？例如RNAlater保存的组织在提取前需去除保存液，否则高盐会干扰柱式纯化。
四、现场操作要点与污染控制
现场操作应遵循“快、冷、净、分”四字原则。快：缩短离体到灭活的时间，组织切块、加液、速冻一气呵成。冷：操作台、器械、离心机尽量预冷，样本全程置于冰上或液氮中。净：使用无RNase耗材，戴手套、口罩，勤换手套，避免说话和咳嗽直对样本。分：样本分装成小份，避免反复冻融；不同样本、不同时间点分开标记，防止交叉污染。
器械处理方面，金属器械可经180℃干热灭菌4小时以上，或使用RNase去除剂浸泡后无RNase水冲洗。台面用70%乙醇或RNase去除剂擦拭。移液器吸头、离心管必须使用标注“RNase-free”的产品。
五、降解风险的现场判断
现场无法直接测RIN，但可通过一些信号预判风险：组织颜色变暗、发黏、有异味，提示缺血或自溶；血液样本出现溶血（上清发红），提示RNA可能已释放并降解；样本在室温停留超过30分钟且未加保存液，风险显著升高。遇到这些情况，应在实验记录中标注，并在后续质检时重点关注。
把上述环节串起来看，RNA样本质量管理的本质是一条时间—温度—酶活的竞争链：离体后越早灭活内源酶、越严格阻断外源酶、越稳定地维持低温或保存液环境，RNA完整性就越好。现场操作中，宁可多花一分钟确认器械和耗材是否无RNase，也不要因为赶时间而让整批样本在室温下暴露。后续质检若发现RIN偏低，应回溯采样记录中的时间点、保存方式和运输条件，定位是哪一个环节引入了降解，而不是简单归因于提取试剂盒。