2. 样本类型与实验设计对接

同一套建库试剂盒，面对不同样本类型时，前处理与质控策略往往需要重新设计。原因在于：不同样本的核酸来源、完整性、丰度、杂质谱和可重复取样性差异极大，这些差异会直接决定“提取什么、怎么提、提完测什么、测到什么程度才能进入建库”。本节按样本类型逐一拆解其前处理与质控的差异化要求，并给出可对接实验设计的判断依据。

一、基因组DNA：以完整性和纯度为核心

基因组DNA（gDNA）通常来自血液、组织、培养细胞，目标是获得高分子量、低断裂的完整DNA。前处理的关键是温和裂解与充分去蛋白：血液样本常用蛋白酶K消化配合盐析或柱纯化，组织样本需先充分匀浆再裂解，避免机械剪切造成额外断裂。质控上，完整性优先看片段分布而非单一浓度值：琼脂糖凝胶电泳应呈现清晰的高分子量主带，无明显弥散拖尾；若用片段分析仪，gDNA的DIN值（DNA Integrity Number）一般要求≥7，全基因组测序建议≥8。纯度方面，A260/A280应在1.8～2.0，A260/A230应≥2.0，偏低往往提示蛋白或盐类残留，会抑制后续酶反应。浓度可用Qubit荧光法准确定量，避免NanoDrop受RNA或游离核苷酸干扰而高估。实验设计对接上，gDNA适合全基因组测序、WGS、WES和长读长建库，投入量通常为100 ng～1 μg；若DIN偏低，应改用片段化建库或调整打断时间，而不是强行按完整DNA流程操作。

二、总RNA：完整性与rRNA残留决定成败

总RNA的前处理核心是抑制RNase并保持转录本完整。样本离体后应尽快加入裂解液或液氮速冻，避免RNA降解。提取常用Trizol法或硅胶柱法，前者适合大样本量，后者适合微量样本。质控上，RIN值（RNA Integrity Number）是最重要的完整性指标，真核样本一般要求RIN≥7，若做转录组测序建议≥8；原核RNA无RIN，可用RQS或电泳图判断23S/16S比例。纯度要求A260/A280在1.9～2.1，A260/A230≥2.0。此外，总RNA中rRNA占比常达80%以上，若做mRNA测序需先进行poly(A)富集或rRNA去除；若做全转录组，则需评估rRNA去除效率。实验设计对接上，RNA-seq投入量通常为100 ng～1 μg总RNA，微量样本可低至10 ng但需增加扩增循环并警惕偏差；若RIN偏低，可改用3'端测序或降解样本专用建库策略。

三、cfDNA：低丰度、短片段与高灵敏度检测

cfDNA（游离DNA）主要来自血浆，含量极低（常为1～100 ng/mL血浆），片段短（约167 bp及其整数倍），且易被背景gDNA污染。前处理必须采用无创采集、双层离心去除细胞，避免溶血释放gDNA。提取建议使用专门针对短片段优化的磁珠法或柱法，洗脱体积尽量小以提高浓度。质控上，浓度常用Qubit或数字PCR，片段分析应显示167 bp主峰及约330 bp次峰；若出现高分子量拖尾，提示gDNA污染，需评估是否影响低频突变检测。实验设计对接上，cfDNA常用于液体活检、无创产前检测和肿瘤突变监测，建库投入量可低至1～10 ng，需采用低输入量建库试剂盒并增加唯一分子标签（UMI）以校正偏差；若片段分布异常，应重新评估采集与离心流程，而非直接加大投入量。

四、FFPE：交联、降解与去交联处理

FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）样本的核酸被甲醛交联且高度片段化，DNA常为100～300 bp，RNA更易降解。前处理需先脱蜡（二甲苯或加热法），再经蛋白酶K消化和去交联（高温孵育）释放核酸。质控上，DNA的DIN值通常较低（2～5），不能按gDNA标准要求；应关注片段是否集中在可建库范围（如150～250 bp），并用qPCR评估可扩增性。RNA的DV200（片段大于200 nt的比例）比RIN更适用，DV200≥30%通常可尝试建库。纯度方面需注意石蜡和二甲苯残留，A260/A230可能偏低。实验设计对接上，FFPE适合靶向测序、肿瘤panel和转录组，建库需使用耐降解样本的试剂盒，投入量可低至10～50 ng；若DV200或可扩增性不足，应优先考虑降解样本专用方案或改用靶向小panel。

五、单细胞：从组织解离到单细胞悬液质控

单细胞样本的前处理核心是获得高活率、低粘连、无游离核酸的单细胞悬液。组织需先切碎、酶解（如胶原酶/胰蛋白酶），再过滤和洗涤；解离时间过长会诱导应激基因表达，过短则细胞得率低。质控上，活率应≥80%（最好≥90%），细胞浓度需准确（如700～1200 cells/μL），且悬液中无大量碎片和双细胞团。若做单细胞RNA测序，还需评估细胞直径与RNA含量，避免过小细胞丢失。实验设计对接上，单细胞测序投入的是细胞悬液而非核酸，因此前处理与质控必须在线完成：活率不足时需重新解离或增加死细胞去除步骤；双细胞率高时需优化浓度或增加过滤。若样本本身RNA含量低，可选用全长转录本捕获方案或增加测序深度。

六、差异化策略的对接原则

把上述五类样本放在一起看，可以提炼出三条对接原则。第一，质控指标必须与样本类型匹配：gDNA看DIN，RNA看RIN，cfDNA看片段峰形，FFPE看DV200和可扩增性，单细胞看活率和双细胞率，不能拿同一把尺子量所有样本。第二，投入量由质控结果反推：浓度和完整性共同决定建库起始量，低质量样本应优先选择耐降解或低输入方案，而不是简单加大体积。第三，前处理与实验设计要同步确定：例如cfDNA必须用UMI校正低频突变，FFPE必须选靶向panel而非全基因组，单细胞必须在线完成活率质控。只有把样本特性、前处理、质控和建库策略串成一条链，才能避免“提取合格但建库失败”的常见问题。