4. 核酸提取与质量评估

核酸提取是测序实验的第一个“数据质量关口”。样本中核酸的浓度、纯度与完整性，直接决定后续建库能否成功、测序数据是否可靠。本节围绕“怎么选方法、怎么测质量、怎么判断合格、出问题怎么处理”展开，帮助你把提取环节做成可复现、可判断的工程步骤。

一、提取方法怎么选

选择提取方法的核心依据是样本类型、目标核酸种类、通量规模和对完整性的要求。常见方法可分为三类：

• 柱式离心法（硅胶膜）：适合中小通量、对纯度要求高的样本，如血液、培养细胞、组织。操作稳定，但片段化程度相对较高，对长读长或大片段文库不友好。
• 磁珠法：适合高通量自动化，如96孔板、工作站。磁珠法对微量样本和降解样本更友好，可通过调整磁珠比例选择片段大小，但成本较高，且磁珠残留可能抑制酶反应。
• 沉淀法（如异丙醇/乙醇沉淀）：适合大体积样本或需要保留大片段DNA的场景，如长读长测序。操作步骤多、耗时长，但能得到较完整的核酸。

以实际选择为例：若样本是新鲜外周血，目标是全基因组测序，推荐柱式法或磁珠法，优先保证纯度和产量；若样本是FFPE组织，核酸已部分降解，应选磁珠法或专用FFPE提取试剂盒，并适当增加起始量；若要做长读长测序，则优先选择沉淀法或大片段富集磁珠法，避免过度剪切。

二、浓度与纯度检测

提取完成后，必须同时测浓度和纯度。常用手段是紫外分光光度计（如NanoDrop）和荧光定量（如Qubit）。两者原理不同，结果不能互相替代。

紫外法通过A260、A280、A230吸光度计算：

• A260/A280：反映蛋白质污染。DNA理想值约1.8，RNA约2.0。低于1.7提示蛋白或酚残留。
• A260/A230：反映盐、糖、胍盐等污染。理想值约2.0～2.2。低于1.8提示盐类或有机溶剂残留。
• 浓度：dsDNA按A260×50 ng/μL估算，但该值受RNA、单链核酸和污染物干扰，仅作参考。

荧光法（Qubit）只与双链DNA结合，特异性高，适合准确定量。实际工作中建议紫外法看纯度，荧光法定浓度。例如：NanoDrop测得浓度120 ng/μL，但Qubit只有45 ng/μL，说明紫外读数被RNA或污染物抬高，应以Qubit为准。

三、完整性评估

完整性反映核酸是否断裂。DNA常用琼脂糖凝胶电泳观察主带是否清晰、有无拖尾；更精确的方法是片段分析仪或脉冲场电泳，给出DIN值（DNA Integrity Number，1～10，越高越完整）。RNA则用RIN值（RNA Integrity Number，1～10），RIN≥7通常满足转录组测序要求，RIN<5则降解严重。

对于全基因组测序，DNA主带应大于20 kb，无明显小片段拖尾；对于RNA-seq，28S/18S比值应接近2:1，且RIN达标。若完整性不足，可尝试减少提取过程中的剪切力（如减少吹打、降低离心转速、避免反复冻融），或改用更温和的提取方法。

四、常见问题与处理

问题1：A260/A280偏低（<1.7）。说明蛋白质或酚残留。处理方式：增加蛋白酶K消化时间，或在提取后加一步酚氯仿抽提，再用乙醇沉淀。若样本量少，可改用柱式纯化。

问题2：A260/A230偏低（<1.8）。常见于胍盐残留或盐浓度过高。处理方式：用70%乙醇多洗一次，或做乙醇沉淀后弃上清、晾干。注意不要过度干燥，否则核酸难溶。

问题3：浓度低但纯度正常。可能是起始样本量不足、裂解不充分或洗脱体积过大。处理方式：增加起始量、延长裂解时间、减少洗脱体积（如从100 μL降到30 μL），或改用微量提取试剂盒。

问题4：完整性差（DIN低或RIN低）。常见原因是样本反复冻融、提取过程剪切力过大、样本本身已降解。处理方式：新鲜样本尽快提取，避免反复冻融；操作时减少吹打、降低离心转速；若样本已降解，可尝试磁珠法富集大片段，或调整建库策略。

五、可执行的提取质量检查清单

以下清单可直接用于每次提取后的质量判断，建议随实验记录一并填写：

把上述检查结果记录在实验记录中，并与建库结果对照，可以逐步建立本实验室的“提取—建库”质量关联，从而在后续实验中快速判断哪一步需要优化。核酸提取不是孤立步骤，而是测序数据质量的起点，只有把浓度、纯度和完整性都控制在合理范围内，后续建库和测序才有可靠的基础。