3. 样本采集、保存与运输
测序结果的上限，往往在样本离开生物体的那一刻就已经被决定。核酸在离体后迅速面临酶解、氧化、微生物增殖和化学修饰，而不同样本基质对降解的敏感程度差异极大。本节围绕“采集—保存—运输—质控”这条链路，说明不同样本类型的规范操作、保存液的选择逻辑、冷链参数，以及如何在进入建库前判断样本是否可用。
一、不同样本类型的采集规范
样本类型决定了采集容器、抗凝剂、采集量和处理时限，不能一概而论。
- 外周血（gDNA）：优先使用 EDTA 抗凝管（K₂EDTA），采血量常规 2～5 mL。肝素会抑制后续酶反应，除非有明确去除方案，否则不用于 gDNA 建库。采血后轻柔颠倒混匀 8～10 次，避免剧烈振荡导致溶血。
- 外周血（cfDNA）：必须使用含稳定剂的专用采血管（如 Streck cfDNA BCT 类），可室温稳定数天；若用普通 EDTA 管，需在 4～6 h 内完成血浆分离，否则白细胞裂解释放的基因组 DNA 会严重稀释真实 cfDNA 信号。
- 新鲜组织：离体后 30 min 内切成 ≤0.5 cm³ 小块，液氮速冻或直接投入 RNAlater。肿瘤组织应避开坏死区，必要时由病理确认肿瘤细胞含量（一般要求 ≥20%）。
- FFPE 组织：关注固定时间（推荐 6～24 h 中性缓冲福尔马林），固定不足或过度都会影响核酸提取质量；切片厚度与存放时间需记录。
- 唾液：采集前 30 min 禁食、禁水、禁烟，使用含保存液的专用采集器，避免口腔黏膜脱落细胞过多引入宿主与微生物比例失衡。
- 粪便：新鲜样本应在 15 min 内分装并冻存或加入保存液，因为肠道菌群组成在室温下数小时内即发生显著漂移。
- 培养细胞：弃培养基后用 PBS 轻洗，直接加裂解液或冻存，避免反复冻融。
二、保存液的选择逻辑
保存液的核心作用是抑制核酸酶、稳定细胞膜或裂解细胞并固定核酸。选择时按“样本类型 + 下游用途 + 运输时长”三个维度判断：
- RNAlater：适用于组织与细胞，通过高浓度硫酸铵沉淀核酸酶，样本可在 4 ℃ 保存数天、-20 ℃ 长期保存。缺点是会稀释样本，且不适用于血液。
- DNA/RNA Shield 类：可裂解细胞并灭活酶，适合唾液、粪便、拭子，室温运输友好。
- cfDNA 稳定剂：通过固定白细胞膜防止基因组 DNA 释放，是 cfDNA 运输的关键。
- 乙醇/异丙醇：用于已纯化核酸的沉淀保存，不用于原始样本。
保存液不是“越强越好”。若下游要做微生物组或活菌分析，强裂解型保存液会破坏可培养性；若只做核酸测序，则优先选择灭活型保存液以提升运输安全性。
三、冷链运输参数
温度是运输环节最容易被忽视却影响最大的变量。常用区间如下：
| 温度区间 | 适用样本 | 关键控制点 |
|---|---|---|
| 室温（15～25 ℃） | 含稳定剂的 cfDNA 管、DNA/RNA Shield 样本 | 避免阳光直射，记录启运与到达时间 |
| 4 ℃ | 短期运输的全血、组织 | 冰袋+保温箱，避免直接接触冰袋造成局部冻结 |
| -20 ℃ | 已冻存核酸、部分组织 | 干冰或低温冰袋，防止反复冻融 |
| -80 ℃ / 干冰 | 长期保存样本、RNA 样本 | 干冰量按运输时长 1.5 倍估算，箱内留温度记录仪 |
运输中应放置温度记录仪，到达后核对全程温度曲线是否越限。若出现温度波动，需评估波动幅度与持续时间，再决定是否继续建库。
四、样本质量控制
进入建库前，至少完成以下质控判断：
- DNA 样本：Qubit 定量（不依赖 Nanodrop 的 A260/A280 作为唯一依据），A260/A280 在 1.8～2.0，A260/A230 ≥2.0；琼脂糖凝胶或片段分析确认无明显降解拖尾。
- RNA 样本：RIN 值 ≥7（常规转录组），A260/A280 在 1.9～2.1；若 RIN 偏低但目标为降解容忍型文库，需在报告中注明。
- cfDNA：片段分布以 167 bp 主峰为主，高分子量峰占比过高提示白细胞裂解污染。
- 微生物样本：关注宿主 DNA 比例与菌群多样性，必要时先做 qPCR 评估细菌载量。
质控不合格的样本不应“先建库看看”。低质量输入会放大批次效应，导致数据不可解释，且浪费测序成本。建议在样本接收环节设置明确的放行/拒收标准。
五、链路可视化：从采集到放行
下图把本节的关键对象、保存液选择、温度区间与质控放行判断整合为一条可对照的链路，便于在实际操作中逐项核对。
把上述链路固化为实验室的样本接收 SOP，并在每个节点留下可追溯记录，才能保证后续建库与测序的数据真正反映样本本身的生物学状态，而不是运输与保存过程引入的假象。