2. 样本类型与实验设计

测序实验的成败，往往在拿到样本、决定“测什么、怎么测”的那一刻就已经决定了大半。同一份生物材料，提取成 DNA 还是 RNA、打成单细胞悬液还是保留为组织块，后续可回答的生物学问题完全不同；而同一个科学问题，用全基因组重测序、外显子捕获、转录组或单细胞转录组去回答，成本、数据结构和分析路径也相差悬殊。本节的核心，就是建立“样本类型—实验目标—测序策略”三者之间的匹配判断能力。

一、三类样本的本质差异

DNA 样本反映的是基因组的“静态信息”。它相对稳定、易保存，提取后可在 −20 ℃ 或 −80 ℃ 长期存放，对降解的容忍度较高。DNA 测序回答的是“有什么变异、拷贝数如何、序列是什么”，例如 SNP/InDel、结构变异、拷贝数变异、物种鉴定、甲基化（经亚硫酸氢盐转化后）。DNA 的复杂度高、重复序列多，因此对读长和覆盖均匀性有特定要求。

RNA 样本反映的是“动态表达信息”。它极不稳定，RNase 无处不在，采样后必须立即液氮速冻或使用 RNAlater 等保护试剂，提取过程需在低温、无 RNase 环境下进行。RNA 测序回答的是“哪些基因在表达、表达量多少、有哪些剪接异构体、融合基因”，其最大特点是存在 rRNA 占比极高（总 RNA 中常达 80%～90%）以及表达量动态范围极大（可跨越 5～6 个数量级）。因此 RNA 建库的关键动作是“去 rRNA”或“富集 mRNA（polyA 捕获）”，否则测序数据会被 rRNA 严重稀释。

单细胞样本则是在 RNA 基础上增加了“空间分辨率”维度。它要求组织被解离为高质量单细胞悬液，核心质控指标是细胞活率（一般要求 > 80%～90%）和细胞浓度（常见目标 700～1200 cells/μL），且需避免细胞团聚和游离核酸。单细胞测序回答的是“细胞异质性、细胞类型组成、发育轨迹、稀有细胞亚群”等问题，其数据量按细胞数放大，一个 5000 细胞的实验通常需要数万至数十万 reads/细胞的有效数据。

二、实验目标如何反向决定策略

实验设计应从“问题”出发，而不是从“手头有什么样本”出发。若目标是检测胚系致病位点，通常选择全外显子测序（WES），目标区域约 30～50 Mb，推荐有效深度 ≥ 100×，以保证杂合位点被稳定检出；若目标是肿瘤体细胞突变，则需肿瘤—对照配对样本，肿瘤样本深度常需 200× 以上，以捕捉低丰度变异。若目标是差异表达分析，常规 RNA-seq 每组 3 个生物学重复、每样本 20～30 M reads 即可满足多数基因的定量需求；但若关注低表达基因或可变剪接，则需提高到 50～100 M reads。

单细胞实验的设计逻辑又不同：它首先受限于细胞数。假设要区分 10 种细胞类型，每种类型至少需要 100～200 个细胞才能稳定估计比例，则总细胞数应达到 2000～5000 个，并预留 20%～30% 的损耗。测序深度上，若只做细胞分群，约 20 000～50 000 reads/细胞即可；若要做拟时序或差异表达，则建议 50 000～100 000 reads/细胞。这里存在一个典型的权衡：细胞数越多，单细胞深度越浅；细胞数越少，单细胞深度越深。设计时必须明确“优先保细胞数还是保深度”。

三、样本质量与建库策略的联动

样本质量直接决定建库路线。以 RNA 为例，若 RIN 值 ≥ 7，可采用标准 polyA 富集建库；若 RIN 在 4～7 之间，polyA 捕获效率下降、3' 偏好增强，此时可改用去 rRNA 建库或专门的低质量 RNA 建库方案；若 RIN < 4，则常规转录组已不可靠，需考虑降解样本专用试剂盒或改用 qPCR 等替代方案。DNA 方面，若样本存在严重降解（如 FFPE 样本），短读长建库会因片段过短而效率低下，需采用专门修复损伤的建库方式，并接受更高的重复率。

单细胞样本的质控更为严格。解离后应尽快上机，避免细胞在悬液中长时间停留导致活率下降和基因表达谱漂移。上机前建议用台盼蓝染色或自动细胞计数仪复核活率与浓度，若活率低于 80%，可尝试死细胞去除（如磁珠去除或流式分选），但需注意分选过程本身可能引入应激基因表达。一个常见的教学示例是：某组织解离后活率仅 65%，直接上机后空液滴比例偏高、有效细胞数远低于预期；经死细胞去除后活率提升至 88%，有效细胞回收率明显改善。这类判断依据应成为实验记录的一部分。

四、匹配原则的落地检查

在正式建库前，建议用一份简短的匹配检查表逐项确认，避免“样本—目标—策略”错配。以下为可直接参考的检查项：

需要强调的是，测序策略没有“最好”，只有“匹配”。同一份血液样本，提取 DNA 做 WGS 与提取 RNA 做转录组，得到的是完全不同的信息维度；同一份肿瘤组织，做 bulk RNA-seq 得到的是平均表达谱，做单细胞测序得到的是细胞组成图谱。实验设计的专业能力，正体现在能否根据目标精度、样本条件和预算约束，做出可解释、可复现、可判读的选择。