3. 基因组DNA提取与纯化

全基因组测序对起始DNA的质量要求远高于普通PCR或克隆实验。原因很直接：建库过程中的酶切、末端修复、接头连接、PCR扩增都对模板的完整性和纯度敏感，而测序读长、覆盖均匀度、重复率等指标又直接受起始DNA状态影响。因此，提取与纯化不是“把DNA拿出来”这么简单，而是要在产量、纯度、完整性三者之间取得平衡。本节围绕三条主流技术路线——酚氯仿法、柱式提取法、磁珠法——讲清原理差异，再落到完整性、纯度、浓度的检测方法与合格标准。

三种提取纯化方法的原理差异

酚氯仿法属于液相萃取。细胞裂解后加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（常用25:24:1），酚使蛋白质变性，氯仿促进分层并去除酚残留，异戊醇降低表面张力、减少泡沫。离心后体系分为三层：上层水相含DNA，中间层为变性蛋白，下层为有机相。吸取水相后用氯仿再抽提一次，最后用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤盐分，溶解于TE或纯水。它的优点是片段大、单链断裂少，适合需要长片段的应用；缺点是操作繁琐、接触有毒试剂、残留酚会抑制下游酶反应，且难以高通量。

柱式提取法基于硅胶膜在离液盐（如盐酸胍）存在下对核酸的吸附。高盐条件下DNA的磷酸骨架被阳离子中和，暴露的硅羟基与DNA形成氢键吸附；随后用含乙醇的洗涤液洗去蛋白、盐和残留离液盐；最后用低盐缓冲液或水洗脱，恢复水合状态使DNA脱离膜。柱式法速度快、重复性好、无需有机试剂，但离心柱的剪切力和膜结合容量限制了片段长度，通常回收的DNA多在30 kb以下，且柱容量有限，过量上样会造成明显损失。

磁珠法利用羧基或硅基磁珠在特定PEG/NaCl缓冲体系中可逆结合DNA。通过调节结合液浓度，可实现对不同片段长度的选择性吸附：高浓度PEG偏向吸附大片段，低浓度偏向小片段，这正是磁珠用于片段筛选（如建库中的0.6×/0.8×比例筛选）的基础。磁珠法易于自动化、通量高、样本需求低，但磁珠批次差异、结合条件波动会影响回收率与片段分布，需要严格控制结合时间、温度和磁珠比例。

DNA完整性检测：凝胶电泳与片段分析

完整性反映的是DNA链的断裂程度。最常用的初筛手段是琼脂糖凝胶电泳：取1～2 μL DNA样品与上样缓冲液混合，在0.8%～1%琼脂糖凝胶、1×TAE缓冲液中，5 V/cm电压下电泳30～40分钟，EB或GelRed染色后紫外成像。高质量基因组DNA应呈现一条靠近加样孔、分子量大于20 kb的清晰主带，点样孔附近无明显滞留，泳道内无弥散拖尾（smear）。若主带下方出现明显弥散或小片段富集，说明存在降解。

更定量的方法是脉冲场凝胶电泳（PFGE）或基于毛细管电泳的片段分析仪（如Agilent TapeStation、Fragment Analyzer）。以TapeStation的基因组DNA assay为例，其输出DIN值（DNA Integrity Number，1～10）：DIN≥7通常视为合格，DIN≥8为高质量；若DIN＜6，降解明显，建库后可能表现为插入片段偏短、重复率升高。对于长读长测序（如PacBio、Nanopore），对完整性的要求更高，往往需要DIN≥8甚至更高，并配合大片段提取方案。

纯度检测：A260/A280与A260/A230

纯度用紫外分光光度计（NanoDrop等）测定。核酸在260 nm有最大吸收，蛋白质在280 nm，盐、酚、胍盐等污染物在230 nm附近有吸收。两个比值各有分工：

• A260/A280：反映蛋白质污染程度。纯DNA应在1.8～1.9之间。低于1.7提示蛋白或酚残留；高于2.0可能提示RNA污染或样品过于稀释导致读数不稳。
• A260/A230：反映盐、胍盐、酚、糖等污染。纯DNA通常应≥2.0，理想在2.0～2.2。低于1.8提示离液盐或酚残留，会抑制建库酶反应。

需要注意，NanoDrop测的是吸光度，对降解片段和完整片段一视同仁，因此纯度合格不代表完整性合格。此外，若样品浓度低于10 ng/μL，A260/A280的读数误差会明显增大，此时应改用荧光染料法（Qubit、PicoGreen）定量，或先浓缩再测。

浓度检测：紫外法与荧光法的区别

紫外法（NanoDrop）测的是所有在260 nm有吸收的物质，包括RNA、游离核苷酸、单链DNA，因此会高估双链DNA浓度。荧光法（Qubit dsDNA HS/BR）使用只与双链DNA结合的荧光染料，特异性强，读数更接近真实双链DNA量。建库投入量应以荧光法结果为准，紫外法结果仅作参考。两者差异过大（如紫外值明显高于荧光值）往往提示存在RNA或降解小片段。

合格标准与判定示例

以常规Illumina全基因组测序（插入片段约350 bp，目标覆盖度30×）为例，起始DNA的常见合格标准可归纳为：浓度≥20 ng/μL（荧光法），总量≥500 ng；A260/A280在1.8～1.9；A260/A230≥2.0；DIN≥7；电泳主带清晰、无明显拖尾。若做长读长测序，则要求浓度更高、DIN≥8、片段更大。

方法选择建议

若样本量少、需要高通量或自动化，优先磁珠法；若追求高完整性、用于长读长测序，酚氯仿法或大片段磁珠方案更合适；若样本为常规培养细胞、血液，柱式法在速度与纯度之间平衡较好。无论哪种方法，提取后都应尽快完成质检，避免反复冻融；短期保存于4℃、长期保存于-20℃或-80℃，并分装以减少冻融次数。