2. 样本采集与质量控制
全基因组测序（WGS）对DNA的完整性、纯度和总量要求远高于靶向测序。一个合格的WGS样本，从采集那一刻起就决定了后续数据质量的上限。本节围绕血液、唾液、组织三类常见样本，讲清采集规范、运输保存条件，以及DNA提取前必须完成的QC指标与常见问题处理。
一、三类样本的采集规范
血液样本是WGS最常用的样本类型。推荐使用EDTA抗凝管（紫帽），采血量通常为2～5 mL。EDTA能有效螯合Ca²⁺，抑制凝血级联并灭活DNase，对后续DNA完整性最友好。肝素抗凝管（绿帽）应避免使用，因为肝素是PCR和酶切反应的强抑制剂，即使经过纯化也可能残留，导致建库失败。采血后应立即轻柔颠倒混匀8～10次，使抗凝剂充分作用，切忌剧烈振荡，否则会造成白细胞破裂、释放基因组DNA，反而增加背景游离DNA比例。
唾液样本采集无创、易接受，适合大规模人群队列。但唾液中含有大量细菌、食物残渣和口腔脱落上皮细胞，人源DNA占比可能低至10%～30%。采集前30分钟应禁食、禁水、禁烟，并用清水漱口。使用专用唾液采集器（如含稳定液的收集管）时，按说明书采集1～2 mL，立即与稳定液混匀。稳定液的作用是抑制核酸酶、固定细胞，室温下可稳定数周。若使用普通离心管收集唾液，则需尽快低温处理，否则细菌会快速繁殖，导致人源DNA比例进一步下降。
组织样本包括新鲜组织、冷冻组织和FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织。新鲜组织离体后应在30分钟内切成≤0.5 cm³的小块，液氮速冻后转入-80℃保存，或直接放入RNAlater等保存液中。FFPE样本的DNA常发生交联和片段化，用于WGS时需评估片段大小，通常要求主带≥1 kb，否则建议改用靶向测序。组织采样应避开坏死区和脂肪组织，优先取肿瘤细胞含量高的区域，并同步留取癌旁正常组织作为对照。
二、运输与保存条件
样本运输的核心原则是控温、防震、防反复冻融。血液样本在4℃条件下可稳定24～48小时，超过48小时白细胞会逐渐凋亡，基因组DNA开始降解，表现为琼脂糖凝胶电泳主带变模糊、出现小片段拖尾。若需长期保存，应分离白膜层或直接冻存全血于-80℃，避免使用-20℃，因为-20℃下冰晶反复形成会机械剪切DNA。
唾液样本若使用含稳定液的专用采集器，可在室温下稳定数周，运输时无需冰袋，极大降低了物流成本。但若使用无稳定液的普通管，必须4℃冷藏并在24小时内处理，否则细菌过度生长会导致人源DNA占比骤降，后续建库时细菌序列大量占用测序数据。
组织样本的运输必须使用干冰，确保全程-70℃以下。反复冻融是组织DNA降解的首要原因，每次冻融都会产生冰晶切割DNA。建议在初次冻存前就将组织分装成小份，每份仅够一次提取使用，避免整块组织反复取用。FFPE样本常温运输即可，但需注意防潮，提取前应评估DNA片段化程度。
三、DNA提取前QC指标
在进入DNA提取之前，必须对样本进行QC，判断其是否满足WGS建库要求。核心指标包括：
- 总量：WGS建库通常需要≥1 μg DNA，推荐≥3 μg。总量不足会导致建库时PCR循环数增加，引入扩增偏倚和重复序列。
- 纯度：OD260/280应在1.8～2.0之间。低于1.8提示蛋白质或酚类污染；高于2.0提示RNA残留。OD260/230应>1.8，低于此值提示盐离子、乙醇或胍盐残留，会抑制后续酶反应。
- 完整性：琼脂糖凝胶电泳主带应≥20 kb，无明显小片段拖尾。若主带弥散或集中在低分子量区域，说明DNA已严重降解，不适合WGS。
- 人源DNA占比：唾液样本尤其需要关注。可通过qPCR扩增人源特异性基因（如β-actin）与细菌16S rRNA基因对比评估。人源占比低于50%时，WGS数据中细菌序列会显著增加，影响变异检测灵敏度。
四、常见问题处理
问题1：血液样本溶血。溶血后血浆呈红色，白细胞破裂释放DNA，但同时也释放大量DNase。处理方式：若溶血轻微，可尝试分离白膜层后提取；若溶血严重，建议重新采样。预防措施是采血后避免剧烈振荡和高温存放。
问题2：唾液样本人源DNA占比低。常见于采集前未漱口、采集时间过长或稳定液失效。处理方式：可尝试用差速离心去除细菌和食物残渣，或使用人源细胞富集试剂盒。若占比仍低于30%，建议重新采集。
问题3：组织样本DNA降解。表现为电泳主带模糊、小片段增多。处理方式：若降解程度轻，可尝试缩短提取时间、使用温和裂解液；若降解严重，建议改用FFPE样本的建库策略或重新取样。预防关键是离体后快速冷冻、避免反复冻融。
问题4：OD260/230偏低。提示盐离子或有机溶剂残留。处理方式：用70%乙醇洗涤两次，或使用硅胶柱纯化。若为胍盐残留，需增加洗涤体积和次数。
总之，样本采集与QC是WGS实验工程的第一道关口。血液、唾液、组织各有其采集规范和保存要点，运输过程中控温防震是共性要求。提取前必须完成总量、纯度、完整性和人源占比四项核心QC，并根据常见问题采取针对性处理。只有把好这一关，后续的建库、测序和数据分析才有可靠的基础。