第三章：数据预处理——标准化、降维、聚类

预处理这一步，说白了就是给原始数据“洗个澡”，让它能反映真实的生物学信号。空间转录组的数据尤其麻烦——它既有基因表达的稀疏性，又有空间位置带来的批次效应。
我个人习惯把这三件事串起来做：先标准化抹平测序深度的差异，再用降维压缩信息，最后用聚类把细胞或spot分群。顺序千万别搞反，否则你后续分析全是坑。

3.1 标准化——摆脱文库大小的影响

不同spot捕获到的总RNA量不一样，这是死理。直接拿原始UMI counts做差异分析，结果会严重偏向高表达基因。我见过有人跳过标准化直接跑聚类，结果分出来的群全是按测序深度分的，毫无生物学意义。

我自己在10x Visium数据上最常用LogNormalize：

library(Seurat)
seurat_obj <- NormalizeData(seurat_obj, 
                            normalization.method = "LogNormalize",
                            scale.factor = 10000)

但如果你用的是MERFISH或者Slide-seq这类高分辨率技术，SCTransform更合适。它能把技术方差和生物学方差解耦开。
我曾经在一个MERFISH项目里用LogNormalize跑聚类，结果spot边界特别模糊。换成SCTransform之后，细胞类型的边界一下就清晰了——嗯，这里要注意，SCTransform对内存要求高，建议先过滤掉低表达基因再跑。

3.2 降维——把高维表达降成低维坐标

标准化后的数据通常还有几千个基因（或特征），直接聚类很难。降维的目的就是找出“最重要的几个维度”，让空间点云更容易被分割。
主成分分析（PCA）是绕不开的基础操作。它把基因表达线性投影到方差最大的方向上。我建议至少保留30~50个PC，否则会丢失稀有细胞类型的信息。

seurat_obj <- RunPCA(seurat_obj, 
                     npcs = 50, 
                     features = VariableFeatures(seurat_obj))

为什么是50？你想想，空间转录组每个spot可能混合了两三种细胞，只取20个PC根本抓不住细微差异。我在一个肿瘤切片里遇到过，PC30才捕捉到一种浸润免疫细胞的信号——要是只留20个PC，那群细胞就彻底消失了。

除了PCA，还有几个常用降维方法：

• UMAP/t-SNE：主要用于可视化，不直接用于聚类。
• Harmony：专门去除批次效应的嵌入方法，常接在PCA之后。
• scVI（深度学习）：能同时处理批次效应和零膨胀，但计算量大。

我的一般流程：先跑PCA + Harmony，然后用Harmony的嵌入做聚类。

# 在Seurat中使用Harmony
library(harmony)
seurat_obj <- RunHarmony(seurat_obj,
                         group.by.vars = "orig.ident",
                         reduction = "pca",
                         dims = 1:30)

3.3 聚类——找到空间上的“邻居团”

降维之后，我们终于可以回答核心问题：哪些spot的转录组特征最相似？
空间转录组的聚类和单细胞不一样——spot之间还有空间坐标。你可以用纯转录组的相似性（基于降维距离），也可以结合空间邻域关系。两种思路我都做过：

我个人的默认做法是先用Leiden做转录组聚类，然后用spatial distance做后处理合并。原因很简单——纯Leiden跑得快，结果稳定。如果后续发现某些集群在空间上破碎或者跨区混合，再换成BayesSpace精细校正。

# Seurat中运行Leiden聚类
seurat_obj <- FindNeighbors(seurat_obj, 
                            reduction = "harmony", 
                            dims = 1:30)
seurat_obj <- FindClusters(seurat_obj,
                           resolution = 0.6,  # 分辨率控制粒度
                           algorithm = 4)      # 4 = Leiden

分辨率这个参数特别关键。我习惯先用0.4和0.8各跑一次，然后结合空间特征看一下：高分辨率下如果出现大量小于5个spot的“微簇”，就说明过碎了。反之分辨率太低会把明显不同的细胞类型压在一起。

3.4 整个预处理流程的“流水线”

把上面三个步骤串起来，就是一张清晰的流程图：

你应该能看出，我习惯把可视化和分辨率调优放在并行分支里，而不是线性流程的一部分。因为在得到初步聚类结果后，我总要回头看看UMAP和空间分布图，再决定要不要调整参数——这不是一次性的，往往要迭代两三轮。

3.5 常见坑与我的处理方式

• 标准化后出现负值？ 别慌，SCTransform输出Pearson残差，负值表示比期望值低。这在生物学上没问题，但你可以手动加一个偏移量（比如最小值+1）让所有值非负，不过我很少这么做，因为降维和聚类算法对负值并不敏感。
• 降维时发现PC方差已经饱和？ 比如第20个PC之后方差没有明显下降，这通常意味着数据中有冗余的“技术噪声”，我一般会选择取前30个PC，而不是所有方差贡献显著的PC。
• 聚类结果中有孤立的小群？ 如果那个小群只有1~3个spot且远离其他主群，大概率是dropout噪声。我会手动过滤掉它们（小于5个spot的cluster视为噪声），或者在FindClusters中设min.size = 5。