数据获取与质量评估——打好基础比什么都重要

说实话，空间转录组分析里最容易被低估的环节，就是数据获取和质量评估。我见过不少人一上来就急着跑下游分析，结果花了几周时间，最后发现是数据本身有问题，白白浪费了精力。

2.1 主流数据来源，你得知道去哪找

目前空间转录组数据主要来自两个方向：一个是平台公开的数据，一个是自己跑实验。绝大多数教学和研究用的都是公开数据，常用的有这么几个：

我个人习惯首选 10x Visium 数据，因为它的教程和工具链最成熟。你到 10x Genomics 官网的 Datasets 板块，能找到大量示例数据，包括人类乳腺癌、小鼠脑切片这些经典样本。

2.2 数据落地——把数据拉下来并看懂结构

假设你找到了一个 Visium 数据集，用 wget 下载后，文件夹结构大概是这样：

# 典型的 SpaceRanger 输出结构
sample345/
├── outs/
│   ├── filtered_feature_bc_matrix.h5
│   ├── filtered_feature_bc_matrix/
│   │   ├── barcodes.tsv.gz
│   │   ├── features.tsv.gz
│   │   └── matrix.mtx.gz
│   ├── spatial/
│   │   ├── tissue_positions_list.csv
│   │   ├── scalefactors_json.json
│   │   └── tissue_hires_image.png
│   └── analysis/
│       ├── clustering/
│       └── ...

这里面最关键的是三个文件：

• filtered_feature_bc_matrix.h5 —— 基因表达矩阵，相当于单细胞的表达矩阵，但多了 spot 坐标
• tissue_positions_list.csv —— 每个 spot 的物理坐标 (x, y)，组织在不在组织区域 (in_tissue=1/0)
• scalefactors_json.json —— 图像缩放参数，用来把 spot 坐标映射到组织图像上

2.3 质量评估——别急着建模

数据一到手，我建议先做三件事：

1. 看细胞/spot 数量——是不是太少？一般 Visium 一个切片应该有 3000~5000 个 spot
2. 看基因检出率——中位数基因数太低（比如低于 500），可能组织处理有问题
3. 看组织图像——有没有气泡、褶皱、坏死区域

我常用 Scanpy 或 Squidpy 做初步质控。举个简单的例子，用 Python 读取 H5 数据：

import scanpy as sc
import pandas as pd

# 读取数据
adata = sc.read_10x_h5('outs/filtered_feature_bc_matrix.h5')
adata.var_names_make_unique()

# 简单质控指标
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, percent_top=None, log1p=False)
print(adata.obs['n_genes_by_counts'].describe())

# 过滤低质量 spot
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200)
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3)

print(f"过滤后剩余 {adata.n_obs} 个 spot，{adata.n_vars} 个基因")

结果输出大概长这样：

count    4932.000000
mean      1567.340000
std        413.210000
min        102.000000
25%       1289.000000
50%       1593.000000
75%       1856.000000
max       2873.000000
Name: n_genes_by_counts, dtype: float64
过滤后剩余 4890 个 spot，18543 个基因

这里有个细节：min_genes=200 是单细胞分析的标准阈值，空间转录组可以适当放低到 100。为什么？因为 spot 可能比细胞大，包含多个细胞核碎片，基因检出率天然低一些。

2.4 坐标对齐——让基因和空间位置对上

光有表达矩阵还不够，你得把基因表达数据“贴”到组织图像上。这一步的核心是 tissue_positions_list.csv 这个文件。

我用一个简单的例子说明怎么合并坐标信息：

import pandas as pd
import scanpy as sc

# 读取坐标
coords = pd.read_csv(
    'outs/spatial/tissue_positions_list.csv',
    header=None,
    names=['barcode', 'in_tissue', 'array_row', 'array_col', 'pxl_row_in_fullres', 'pxl_col_in_fullres']
)

# 只保留组织区域的 spot
coords_tissue = coords[coords['in_tissue'] == 1].copy()

# 把坐标加入 adata
adata.obs = adata.obs.join(
    coords_tissue.set_index('barcode')[['pxl_row_in_fullres', 'pxl_col_in_fullres']]
)

# 添加成 spatial 标准格式
adata.obsm['spatial'] = adata.obs[['pxl_col_in_fullres', 'pxl_row_in_fullres']].values

print(f"添加了 {adata.obsm['spatial'].shape[0]} 个 spot 的空间坐标")

2.5 可视化质控——一张图胜过千行代码

我觉得质控中最直观的一步，就是把 UMI 数、基因数用颜色映射到组织图像上。看一眼就知道哪些区域有问题。

import scanpy as sc
import matplotlib.pyplot as plt

# 用 Squidpy 或 Scanpy 绘图
sc.pl.spatial(adata, img_key='hires', 
              color=['n_genes_by_counts', 'total_counts'],
              crop_coord=[1000, 6000, 1000, 6000],
              show=True)

你想象一下，正常组织应该是均匀分布的颜色。如果某个区域突然很暗（基因数极低），那可能是组织折叠、气泡，或者坏死。我以前遇到过一种情况：样本边缘一圈 spot 的基因数只有中心区域的 1/3，后来发现是组织切片时边缘损伤了。

2.6 本章知识结构总览

2.7 常见坑和我的解决建议

做多了你就会发现，数据质控这一步往往比下游建模更花时间。我总结几个常见问题：

2.8 质控后的标准输出格式

完成所有步骤后，你应该得到一个 AnnData 对象，里面包含：

• adata.X —— 过滤后的表达矩阵（spot × gene）
• adata.obs —— spot 级别的元数据（总 UMI、基因数、线粒体比例等）
• adata.obsm['spatial'] —— 像素坐标 (N×2 数组)
• adata.uns['spatial'] —— 图像和缩放参数（可选）

保存成标准格式，方便后续直接读取：

# 保存质控后的数据
adata.write('qc_pass.h5ad')

# 下次直接读取
adata = sc.read('qc_pass.h5ad')

print(adata)
# AnnData object with n_obs × n_vars = 4890 × 18543
#     obs: 'n_genes_by_counts', 'total_counts', 'pct_counts_mt'
#     obsm: 'spatial'
#     uns: 'spatial'

看到这个输出，你就可以放心地进入下一步了——构建细胞邻域图，开始特征建模。记住，数据质量决定了分析的天花板，这一步花再长时间都值得。