三、实验设计：样品制备与捕获芯片
说到Visium实验，我最常被问到的问题是：“组织样本到底该怎么处理？芯片上的那些小圈圈是什么？” 第一个问题，其实大部分问题都出在样品制备阶段。第二个问题，理解了芯片设计，你的质控思路就清晰了一半。
我们直接聊干货。样品制备和芯片捕获，是整个空间转录组实验的“地基”。我这里不讲那些花哨的理论，就按我实际做实验的习惯来拆解。
3.1 样品制备的核心步骤
一个好的空间转录组实验，80%的成败在样品制备。我个人习惯把整个流程分成四个阶段：
- 组织收集与包埋：新鲜组织，越快处理越好。
- 冷冻切片：厚度控制是门手艺活。
- 组织贴片与固定：贴到芯片上，这一步要稳。
- 染色与成像：为后续的空间对齐提供参考。
你想想看，一个不当心的操作，比如切片时卷曲了，或者固定时间不够，后面所有数据都会打折扣。我在项目中遇到过一位同事，组织贴片时用力过猛，结果把芯片上的捕获点阵都给刮花了。嗯… 那批样品最后只能重做。
下面是各步骤的关键参数：
| 步骤 | 关键参数 | 常见问题 | 我个人建议 |
|---|---|---|---|
| 组织包埋 | OCT 包埋剂，-80°C 速冻 | 冰晶形成，组织破碎 | 使用异戊烷辅助速冻，减小冰晶 |
| 冷冻切片 | 厚度 10-20 µm，温度 -20°C | 切片卷曲、褶皱、厚度不均 | 切片前让组织在切片机内平衡30分钟 |
| 组织贴片 | 贴合温度 37°C，无气泡 | 组织与芯片间有气泡 | 用平头镊子轻压，从一侧向另一侧赶走气泡 |
| 组织固定 | 甲醇固定 30 分钟（-20°C） | 固定时间不足导致RNA降解 | 固定后立即进行 H&E 染色或直接透化 |
经验之谈：组织切片厚度不是越薄越好。10 µm 适合细胞密度高的组织（如肿瘤），20 µm 适合细胞稀疏的组织（如脑组织）。太薄的切片容易破裂，太厚则透化不均匀。我一般做脑组织切片用 14 µm，效果比较稳。
3.2 捕获芯片的结构与设计
Visium 芯片的核心，说白了就是一块载玻片上的“捕获点阵”。每个捕获点（Spot）直径 55 µm，点间距 100 µm。每个点里都固连着带有空间条形码（Spatial Barcode）的探针。
为什么会设计成这样？ 每个捕获点捕获到的 mRNA 都会被打上独一无二的条形码。测序之后，我们根据这个条形码就能反推出 mRNA 来自组织切片上的哪个位置。这就是“空间”二字的由来。
我曾经被问到：“一个捕获点大约能捕获多少个细胞？” 这其实要看组织类型。细胞直径一般在 10-20 µm，一个 55 µm 的捕获点，理论上能覆盖 1 到 10 个细胞不等。所以，Visium 的分辨率是“近单细胞”水平，但不是真正的单细胞。
下面这张图把整个实验逻辑串联了起来：
3.3 样品制备阶段的关键质控
样品制备阶段的质控，很多人会忽略。我个人认为，这个阶段的质控比后期生信质控更重要。为什么呢？因为有些问题，生信方法根本救不回来。
3.3.1 RNA 完整性检查
先看组织总 RNA 的 RIN 值（RNA Integrity Number）。这个值低于 7，我建议直接放弃。RIN 值低意味着 RNA 已经降解，捕获到的片段会偏短，而且 3‘ 端偏好性会非常严重。我在项目里遇到过 RIN 值 6.5 的样品，结果分析时大部分基因都在 3’ UTR 区域，没法看。
质控阈值：
- RIN ≥ 7.0：合格
- RIN 介于 6.0 ~ 7.0：高风险，建议做预实验
- RIN < 6.0：坚决重取样
3.3.2 明亮场成像检查
组织贴片到芯片上，经过 H&E 染色后，一定要先拍一张明亮场全切片图。这步是为了看：
- 组织有没有褶皱或破裂
- 有没有明显的气泡
- 组织边缘是否完整
我曾经因为切片时刀片钝了，导致组织切片边缘有锯齿状撕裂。这种样品即便跑完测序，空间对齐也会出错。所以，我建议每张切片都拍一张高分辨率的明场图，存档并检查。
3.3.3 透化时间的优化
这是样品制备阶段最容易出错的地方。透化时间过短，mRNA 释放不出来，捕获效率低；时间过长，mRNA 会扩散到相邻捕获点，造成“空间串扰”。
官方推荐的做法是做透化时间梯度测试。通常用 3, 6, 9, 12, 18, 24 分钟这几个时间点。我在一个胰腺癌项目中测试发现，18 分钟效果最好。但另一个脑组织样本，12 分钟就过透了。所以，不同组织类型必须单独优化。
警告：千万不要跳过透化时间的优化。直接使用官方推荐时间做正式实验，成功概率不超过 30%。你是用别人的数据赌自己的实验，不划算。
3.4 捕获芯片的后处理与存储
样品制备完成后，如果你不打算立刻进行透化和捕获，可以暂时存储。但要注意：
- 贴好组织的芯片，可以短期保存在 -80°C 干燥环境中，最多 1 周。
- 完成 H&E 染色并成像后的芯片，也应尽快进行透化。
- 长时间存储会导致组织脱水，影响 RNA 捕获效率。
说白了，拿到芯片后，最好在 48 小时内完成所有湿实验步骤。放太久的样品，数据质量会肉眼可见地下降。
3.5 我的一点总结
样品制备是一个“慢工出细活”的阶段。我个人建议，实验前花一小时规划好流程，比实验过程中手忙脚乱要强得多。
- 提前准备好预冷好的甲醇、异戊烷、OCT 包埋剂。
- 切片机的刀片一定要锋利，最好每切片一两次就检查一下。
- 组织贴片到芯片上后，先不要急着做透化，看一眼显微镜下有没有气泡。
- 对于每个新组织类型，都先做透化时间梯度测试，哪怕只做一次。
记不记得我开始说的那个刮花芯片的同事？ 后来他每次贴片之前，都会先用镊子轻轻碰一下组织边缘，确认它已经平整地贴合在芯片上。实验习惯就在这个过程中一点点养成了。