1. Visium技术概述与数据生成原理

Visium，说白了就是10x Genomics在2019年推出的空间转录组平台。我个人习惯把它叫做“带着空间坐标的单细胞测序”。它不像单细胞RNA-seq那样把细胞打散，而是保留了组织切片上每个点的位置信息，也就是所谓的空间barcode。

1.1 核心原理：一张芯片，两个关键区域

Visium芯片长什么样？嗯，它本质上是一张玻璃片，上面固定了捕获探针。每个捕获区域（Capture Area）是6.5mm × 6.5mm，下面密密麻麻排布着5000个点（spots）。每个spot直径55μm，中心间距100μm。

为什么要强调这点？因为55μm决定了你的空间分辨率。我曾在一个项目中分析小鼠脑切片，发现某个基因的表达模式正好卡在两个spot之间，结果空间热图看起来是断裂的。那时候我就意识到，理解spot布局是后续所有分析的基础。

参数	数值	说明
捕获区域	6.5mm × 6.5mm	一张芯片有4个捕获区域
Spot数量	~5000 / 区域	实际有效数因组织覆盖而异
Spot直径	55 μm	决定了每个点覆盖多少细胞
中心间距	100 μm	spot之间不重叠
捕获探针	包含空间barcode + UMI + poly(dT)	捕获mRNA的3' polyA尾巴

1.2 数据生成流程：从切片到FASTQ

大部分做Visium项目的朋友，拿到手的是公司或平台提供的数据。但搞明白整个流程，能帮你从根上理解数据质量问题的来源。流程其实就四步：

1. 组织切片与贴片 – 新鲜冷冻或FFPE组织切成10μm薄片，贴在捕获区域上。
2. 组织透化与mRNA捕获 – 用蛋白酶处理组织，让mRNA释放出来，扩散到下方的spot上，被poly(dT)捕获。
3. 逆转录与文库构建 – 在芯片上直接逆转录，cDNA上就带上了空间barcode和UMI。
4. 测序 – 标准Illumina测序，得到FASTQ文件。

1.3 空间barcode与UMI设计

每个spot上固定着数百万条捕获探针。每条探针包含：

• Read 1测序引物 – 用于启动测序
• 空间barcode – 16bp的序列，每个spot唯一
• UMI – 12bp的随机序列，用于标记每个mRNA分子
• poly(dT) – 30个T，捕获mRNA

你想想看，为什么需要UMI？原因很简单：避免PCR重复。如果没有UMI，两个完全相同的reads，你分不清是同一个分子扩增出来的，还是两个不同的分子。我曾在小鼠肝脏样本中见过PCR重复率高达30%的情况，用了UMI deduplication才把噪声降下来。

空间barcode与UMI引物结构示例（5' -> 3'）：
Read1引物(??bp) + 空间barcode(16bp) + UMI(12bp) + poly(dT)(30T)
                            |             |
                    每个spot唯一    每个分子唯一

1.4 数据生成的几个关键特征

分辨率不是单细胞级别

这个必须要说清楚。Visium的55μm直径，每个spot通常包含1到10个细胞，具体取决于组织类型。你在做数据分析时，不能把它当成单细胞分辨率工具来看。

测序深度比单细胞RNA-seq更高

因为每个spot相当于一个小群体，需要的reads数更多。我一般建议每个spot至少2万到5万reads。一个捕获区域5000个spot，就是1亿到2.5亿reads。如果算上4个区域，就是4到10亿reads。嗯，成本确实不低。

组织形态与基因表达共存

Visium在测序之前会先进行H&E染色或免疫荧光染色，并且拍下高清组织图像。这个图像会和基因表达数据对齐，所以你既能看组织形态，又能看基因表达的空间模式。

1.5 Visium技术适用场景与局限

适用场景	局限
肿瘤微环境的空间异质性分析	分辨率不是单细胞级别（每spot含1-10个细胞）
组织区域划分与marker基因定位	捕获效率有限，低表达基因容易丢失
发育生物学谱系追踪	不能像单细胞那样捕获全长转录本
FFPE样本（FFPE版本）	FFPE样本的RNA完整性差，影响数据质量

1.6 知识体系结构图

下面这张SVG图展示了本章的核心知识模块及其关联关系。

1.7 数据生成的实战要点

讲了这么多原理，最后总结几个实战中会遇到的问题：

• 透化时间 – 不同组织差异很大，一般需要做时间梯度实验
• RNA质量 – RIN值低于6的组织，数据质量会断崖式下降
• 组织贴片质量 – 切片有褶皱或气泡，对齐时会很头疼
• 测序饱和度 – 测得太浅基因检出不够，测得太深边际效益递减