# 对单样本逐个看
fastqc sample_R1.fastq.gz -o qc_output/
# 批量看几十个样本
for i in *_R1.fastq.gz; do fastqc "$i" -o qc_output/; done# 单样本
fastqc sample_R1.fastq.gz
# 批处理
ls *.fastq.gz | cut -d'_' -f1 | sort -u | while read id; do
fastqc "${id}"_R1.fastq.gz "${id}"_R2.fastq.gz -o qc_output/
done
小提示：RNA-seq的碱基分布会比DNA-seq波动大一些，因为基因表达本身就有偏向性。但离谱的波动还是不能放过去的。
#### 4.4 Duplicate Rate：文库复杂度的“照妖镜”
**Duplicate是什么？**
就是测序时测到同一个DNA片段的多个拷贝。这些重复reads可能来自：
- PCR duplicate：文库扩增时，同一个模板被扩增了多次
- Optical duplicate：测序仪上的cluster太挤，导致同一个cluster被读成了两个
- 天然的重复：某些区域本身拷贝数就高
**怎么判断是否过高？**
我通常会这样看：
- `< 20%`：理想
- `20%-30%`：可以接受
- `30%-50%`：偏高，需要看具体原因
- `> 50%`：不合格，建议重做
有一次，一个客户送来了50个RNA-seq样本，duplicate rate普遍在40%以上。我一看QC报告，上机总量没问题，但PCR循环数设了18个循环。我建议他降到12个循环试试，结果重复率直接降到15%。说明问题就在扩增环节。
**怎么计算？**
用MarkDuplicates（picard工具）是最常见的。
java -jar picard.jar MarkDuplicates \
I=aligned.bam \
O=aligned_dedup.bam \
M=dedup_metrics.txt \
REMOVE_DUPLICATES=falseLIBRARY UNPAIRED_READS_EXAMINED READ_PAIRS_EXAMINED PERCENT_DUPLICATION ESTIMATED_LIBRARY_SIZE
S1 0 50000000 0.325 33750000
注意：WES和靶向测序的重复率通常比WGS高，因为捕获区域有限。WES重复率40%可能勉强能用，WGS到40%就要警觉了。一定要跟同类项目比，别跨类型。
#### 4.5 三个指标一起看，才算完整评估
单独看任何一个指标都可能误判。我遇到过的情况是这样的：
- Q30高的批次，但duplicate rate也高，有效数据其实很少
- 碱基分布正常的批次，但Q30中段突然下降，后来发现是测序仪液路堵了
- Duplicate rate低的批次，但Q30也低，质量差到没法用
**所以我建议的做法是：**
1. 先跑一次`MultiQC`把所有样本的fastqc报告汇总
2. 生成一张`指标对照表`
3. 标记出三项中至少一项异常的样本
# 安装MultiQC
pip install multiqc
# 汇总所有fastqc报告
multiqc qc_output/ -o multiqc_report/