3、常见测序平台介绍：Illumina、MGI、ONT 归纳总结

做了这么多年 NGS 质控，我个人习惯先把测序平台摸清楚。为什么？因为不同平台的错误模式、批次波动、质控指标都不一样。你拿着一套 Illumina 的质控标准去卡 ONT 的数据，那肯定跑不通。反过来也一样。

这一章咱们把三个主流平台——Illumina、MGI、ONT——的核心技术、典型参数、以及跟批次质控最相关的坑点过一遍。不搞大而全的产品手册，只抓跟排查问题直接挂钩的部分。

3.1 Illumina —— 短读长的市场主力

Illumina 用的是边合成边测序（SBS），说白了就是带着荧光标记的核苷酸一边合成一边拍照。目前市面上绝大多数 NGS 数据都出自它家，从 MiSeq 到 NovaSeq 6000 甚至 X Plus，覆盖了从靶向捕获到全基因组的各种场景。

核心参数速览：

• 读长：主流 2×150 bp，最长能到 2×300 bp（MiSeq v3）
• 通量：NovaSeq X Plus 单次运行可达 6 Tb 以上
• 准确率：Q30 通常 > 85%，高版本试剂能到 90%+
• 错误模式：以 substitutions 为主，GC-rich 区域容易出问题

我记得有一批 NovaSeq 数据，Q30 看着挺漂亮，但 duplicate 率飙到了 40% 以上。排查下来不是测序的问题，是文库浓度不均导致的桥式扩增偏倚。嗯，这里要注意：Illumina 的 duplicate 并不全是 PCR duplicate，跟簇密度、多样性都有关系。你打开 FastQC 的 duplicate 曲线看一眼，如果前端陡升，大概率是多样性不足。

3.2 MGI —— 国产高性价比之选

MGI 的技术路线跟 Illumina 不太一样，它用的是 DNA 纳米球（DNB）加联合探针锚定聚合。说白了就是把文库滚环复制成一个一个的纳米球，然后在一个芯片上铺开测。这样做的好处是扩增 bias 比较小，因为一次滚环复制就够了，不像 Illumina 那样桥式 PCR 会引入偏倚。

核心参数速览：

• 读长：主流 2×150 bp，部分平台支持 2×200 bp
• 通量：DNBSEQ-T7 可以达到 1 Tb / run 以上
• 准确率：Q30 通常 > 85%，与 Illumina 相当
• 错误模式：substitutions 为主，但在 AT-dropout 区域略敏感

我在用 MGISEQ-2000 跑 WGS 时遇到过信号衰减的问题。具体表现是 read 1 的质量正常，但 read 2 从第 80 bp 开始 Q 值断崖下跌。后来发现是 DNB 在芯片上的结合密度太高，信号串扰了。解决方案是把上机浓度调低 15%，问题就缓解了。

MGI 批次问题的常见线索：

• GC dropout 曲线呈"锅盖形"——可能是 DNB 制备不均
• read 2 质量从中间开始下滑——信号衰减，检查上机浓度
• 插入片段偏短——DNB 断裂，排查打断条件

3.3 ONT —— 长读长的利器

ONT（Oxford Nanopore Technologies）走的是另一条路——纳米孔电流检测。DNA 单链穿过蛋白孔，每个碱基造成不同的电流扰动，通过检测电流变化来识别碱基。没有扩增 bias，没有 GC bias，读长只取决于 DNA 碎片长度，理论上能读到 2 Mb 以上。

核心参数速览：

• 读长：N50 通常在 10-50 kb，最长可以到 2.3 Mb
• 通量：最新 R10.4.1 芯片单张 flow cell 能出 10-15 Gb
• 准确率：duplex 模式 > 99%，单次 simplex 约 95-98%
• 错误模式：以 indels 为主，homopolymer 区域最容易出错

我曾经用 ONT 做细菌全基因组拼接，一开始用了快速碱基识别模式，结果出来的基因组缺了好多 homopolymer 的碱基，polish 都救不回来。后来换成了 super-accurate 模式（dna_r10.4.1_e8.2_400bps_sup.cfg），问题才解决。ONT 的碱基识别对模式选择特别敏感，这点在批次质控里必须盯紧。

ONT 批次问题排查要点：

1. 孔活性：如果活性孔低于 60%，可能是芯片保存不当或文库杂质多
2. N50 变化：同一批芯片 N50 波动超过 30%，检查 DNA 打断条件和文库回收步骤
3. 碱基识别质量：如果单次 read 的 Q 值中位数低于 12，考虑换更慢但更准的模型
4. homopolymer 错误：R10.4 芯片对此已有改善，但如果批量出现 5+ 个连续相同碱基的缺失，建议升级到最新 chem 版本

你在跑 ONT 数据时，可以用 NanoPlot 快速拿到质控概览：

# 对一次运行的所有 fastq 做汇总统计
NanoPlot --fastq basecalled_pass/*.fastq.gz -o nanoplot_report

# 重点看这几个指标：
# - Median read length
# - N50
# - Median quality score
# - Number of reads
# 如果 N50 低于预期，大概率是文库打断过度或回收效率有问题

3.4 三大平台横向对比

下面这张表把最核心的几个维度放在一起，方便你快速对照。你在排查批次问题时，第一步就是确认数据来自哪个平台，然后有针对性地检查对应列里的指标。

3.5 从数据快速识别平台

有时候你拿到一批数据，对方没说用什么平台测的。怎么判断？几个小窍门：

• 看 read 长度分布：如果长度集中在 150 bp 或 250 bp 附近，大概率是 Illumina 或 MGI；如果长度从几百 bp 到几十 kb 都有，那基本是 ONT
• 看测序质量分布：Illumina/MGI 的 Q 值曲线前端高后端低；ONT 的 Q 值在整个 read 上比较平坦但整体偏低
• 看 BAM 的 RG 头：运气好会直接写明平台

# 从 BAM 的 RG 头判断测序平台
samtools view -H sample.bam | grep '@RG' | head -1

# 输出示例（Illumina）：
# @RG ID:flowcell1  SM:sample1  PL:ILLUMINA

# 输出示例（MGI）：
# @RG ID:run1  SM:sample1  PL:MGI

# 输出示例（ONT）：
# @RG ID:run1  SM:sample1  PL:ONT  DS:basecall_model=dna_r10.4.1

你看，PL 字段会直接写明平台。如果对方没写，你也可以从 read 名的格式猜个大概——ONT 的 read 名通常很长，而且包含 channel 号和 start_time。