1、课程介绍：RNA-seq 技术背景、Cromwell 优势、全流程概述

RNA-seq 到底是什么？

RNA-seq，全称是 RNA 测序。说白了，就是把细胞里所有的 RNA 分子（主要是 mRNA）拿出来，打成小片段，上高通量测序仪读出来，然后通过计算分析，回答两个核心问题：

• 哪些基因在表达？ —— 定性分析
• 表达量有多高？ —— 定量分析

我记得刚入行时，手写脚本跑一套简单的 RNA-seq 流程，从 fastq 到表达矩阵，大概要折腾三天。中间但凡有一个工具版本不兼容，或者服务器掉线，就得从头再来。到现在，我们用 Cromwell 这样的工作流引擎，一次配置，全自动化执行，还能自动重试失败的任务。效率完全不在一个量级上。

你可能会问：RNA-seq 分析流程有那么复杂吗？我举个例子你就明白了：

嗯，光是工具链就有6个环节，每个环节还有参数调优、版本兼容、资源分配的问题。以前我都是靠 Bash 脚本串联，但脚本一旦跑起来，想要监控进度、断点续跑、并行调度，基本靠运气。这也是为什么 Cromwell 成了我个人最推荐的方案。

Cromwell 的优势在哪里？

Cromwell 是 Broad Institute 开发的开源工作流管理系统。专门用来编排、调度、监控复杂的生物信息学流程。

我个人习惯用 Cromwell 替代传统 Shell 脚本，主要看中这几点：

1. 原生支持 WDL（Workflow Description Language） —— 描述工作流就像写函数定义，输入、输出、步骤依赖写清楚就行，引擎自动调度。
2. 自动并行与重试 —— 样本多的时候，Cromwell 会自动分配资源并行跑；任务失败后自动重试，不用人工盯着。
3. 可移植性强 —— 同一份 WDL 可以在本地、HPC 集群、Google Cloud、AWS 上无缝运行。只需要改配置文件，不用改流程本身。
4. 断点续跑能力 —— 如果流程跑到一半服务器宕机了，重启 Cromwell 后，它会自动从失败的任务继续，不会从头再来。

全流程概述：从 fastq 到差异基因

下面这张图是我们整个 RNA-seq 全流程的核心骨架。它不是工具列表，而是数据流和决策点的抽象。你往后学每一章，都会回到这张图来定位位置。

这个流程看起来是线性的，但实际上每一步都有分支。比如质量控制不过关，你得回到修剪步骤调整参数；比对率太低，可能要换参考基因组或比对器。Cromwell 能很好地处理这种「判断-再跑」的逻辑，因为它支持条件分支和任务依赖。

一个完整的 WDL 工作流长什么样？

这里我给出一个精简版的 WDL 骨架，让你先有个直观印象。不用担心看不懂，后面每一章我都会拆开来讲。

version 1.0

workflow rnaseq_pipeline {
  input {
    Array[File] fastqs
    File genome_fasta
    File gtf
  }

  call quality_control {
    input: fastqs = fastqs
  }

  call trimming {
    input: fastqs = quality_control.clean_fastqs
  }

  call alignment {
    input: fastqs = trimming.trimmed_fastqs,
           genome = genome_fasta
  }

  call quantification {
    input: bam = alignment.sorted_bam,
           gtf = gtf
  }

  output {
    File counts_matrix = quantification.counts
    File alignment_bam = alignment.sorted_bam
  }
}

task quality_control {
  input {
    Array[File] fastqs
  }
  command {
    fastqc ${sep=' ' fastqs}
    multiqc .
  }
  output {
    File report = "multiqc_report.html"
  }
  runtime {
    docker: "biocontainers/fastqc:latest"
    cpu: 2
    memory: "4 GB"
  }
}

这个课程会怎么带你学？

整个课程共 30 章，会按照这张骨架图从顶到底顺序展开。每一章我都会给出一份可运行的 WDL 代码、配置文件、测试数据，还会讲清楚背后的原理和我在实战中踩过的坑。

我建议你准备一台能跑 Docker 的 Linux 或 macOS 机器，至少 8 核 CPU、16 GB 内存。Windows 用户可以用 WSL2。后面我们会一起从零搭建 Cromwell 环境，再从单个 task 写到完整流程，最后部署到云上。

好，第一章的概述就到这。现在你心里应该有了全景图，也知道 Cromwell 为什么值得学。下一节开始，我们就动手搭环境了。