第3章 实验设计：样本制备、切片、探针与测序
说实话，很多人在Visium数据分析翻车，根本原因不在代码写得不好，而是在实验阶段就已经埋下了隐患。这一章我就跟你聊聊，一份靠谱的空间转录组实验，样本从组织块到测序文库究竟经历了什么。
3.1 样本制备——好的开始是成功的一半
Visium平台对样本质量要求相当高。我个人习惯，拿到组织后第一件事不是急着切，而是先做一次RNA质检。RIN值低于7的样本，我通常直接劝退客户——不是不能跑，而是出来数据你会怀疑人生。
样本处理的核心步骤：
- 新鲜冷冻组织（FF）：最佳选择。取下后尽快用OCT包埋，液氮速冻，然后转-80℃保存。切记，不要反复冻融，我见过有人把组织拿出来切一半又放回去，结果那批数据全部报废。
- 固定冷冻组织（FFPE）：Visium现在也支持FFPE样本，多了去交联这一步。需要严格按试剂盒说明书控制消化时间，过长会破坏组织形态，过短则探针进不去。
- OCT包埋：气泡是头号敌人。包埋时让OCT自然渗透几分钟，再缓缓放入液氮，能最大程度避免冰晶形成。冰晶会给切片造成物理损伤，后期聚类时你会看到一堆莫名其妙的人工假象。
3.2 冷冻切片——厚度控制是门手艺
Visium的捕获玻片上每个spot直径55μm，间距100μm。切片厚度推荐10μm，太薄组织容易碎，太厚则通透效率打折扣。
切片流程要点：
- 预冷切片机箱体到-20℃~-25℃，刀架温度也要同步。
- 修片切掉最外层几十微米，露出完整组织切面。
- 正式切片，厚度设定10μm，用防卷板辅助展开。
- 用镊子或细毛笔将切片平整贴到Visium捕获玻片的捕获区域。
- 立即在切片背面轻压，确保组织与玻片紧密贴合。
3.3 H&E染色与组织通透
切片贴好后，先做H&E染色，用来获取组织形态学信息。这一步要特别注意脱水环节——酒精梯度不能省，二甲苯透明度要够，否则显微镜下看不清细胞核。
染色后就是通透。Visium的探针不能穿过完整的细胞膜，需要用蛋白酶K对组织进行消化处理。通透时间太短，mRNA释放不充分；太长则组织结构塌陷，空间信息全乱套了。
通透时间参考表：
| 组织类型 | 推荐通透时间（分钟） | 个人经验调整 |
|---|---|---|
| 小鼠脑 | 12 | 皮质和海马体通透性不同，可微调±2分钟 |
| 人乳腺癌 | 15 | 纤维组织多，我习惯多透2分钟 |
| 小鼠肝 | 8 | 肝细胞脆，通透过头形态全毁 |
| 人肠组织 | 18 | 黏膜层致密，可适当延长 |
3.4 探针原理——Visium到底在测什么
Visium的核心技术其实是一张带空间条形码（Spatial Barcode）的捕获玻片。每个spot覆盖了数百万条捕获探针，每条探针由三部分组成：
- 空间条形码：每个spot唯一，长度16bp，用来锚定转录本的原始位置。
- UMI：唯一分子标识符，12bp，用来消除PCR扩增带来的重复偏差。
- poly-dT序列：30个T碱基，专门捕获mRNA的poly-A尾。
组织透化后，释放出的mRNA会顺着扩散梯度抵达最近的spot，被poly-dT捕获。注意这里是扩散捕获，不是原位杂交。所以mRNA的扩散距离决定了空间分辨率——理论上转录本来自spot周围几个细胞的范围，但实际受透化深度和扩散时间影响很大。
# 一个典型Visium探针的结构示意（以10X标准格式为例）
Read 1 (28 cycles): 空间条形码(16bp) + UMI(12bp)
Read 2 (120 cycles): cDNA插入片段
i7 Index (10 cycles): 样本索引
i5 Index: 无（Visium不需要双端index）3.5 反转录与文库构建
mRNA被捕获后，在玻片上进行原位反转录。反转录引物就是探针本身，cDNA合成后与玻片共价连接，洗掉组织残渣，留下带空间条形码的cDNA文库。
文库构建流程：
- 组织移除：用蛋白酶和洗涤缓冲液把透化的组织彻底洗掉。
- cDNA第二链合成：在玻片上生成双链cDNA。
- cDNA扩增：用PCR扩增cDNA，一般12~14 cycles。
- 片段化与接头连接：将cDNA打断成300~500bp片段，加上P5/P7测序接头。
- 样本index PCR：给每个样本添加唯一的i7索引，方便混合测序。
这里有个容易忽略的点：cDNA产量。我见过很多次反转录效率很低，cDNA浓度只有几十pg/μL，这时候硬往下做，文库复杂度会差到让你怀疑人生。我自己定了个标准：cDNA产量低于100pg就不继续了，重新优化透化时间再说。
# 文库质控常用命令（Qubit或Bioanalyzer读数示例）
Qubit dsDNA HS Assay:
cDNA: 12.5 ng/μL (总量约 375 ng，OK可以继续)
Bioanalyzer High Sensitivity DNA:
文库主峰: 450 bp
无引物二聚体峰，无大片段拖尾
-> 文库质量合格，准备上机3.6 测序——读长配置有讲究
Visium的标准测序方案基于Illumina平台：
| 参数 | 推荐设置 | 说明 |
|---|---|---|
| Read 1 | 28 cycles | 读取空间条形码和UMI |
| Read 2 | 90~120 cycles | 读取cDNA插入片段（转录本信息） |
| i7 Index | 10 cycles | 样本区分 |
| 测序模式 | 单端（非对称） | 只有Read 2用于比对，Read 1负责定位 |
| 推荐深度 | 50,000 reads/spot | 2万~5万之间数据质量差异明显 |
读长配置错了怎么办？我有个朋友用双端150bp跑了Visium，Read 1多出来的122bp全是无意义的序列填充，不仅浪费测序费用，还降低了文库簇密度。所以一定记得跟测序平台约定好custom read length，别套用常规RNA-seq的参数。
3.7 实验流程总览
下面这张图把整个实验管线串起来了，从组织到FASTQ数据，每一步的输入输出一目了然。
3.8 质检标准——哪些数据该提前止损
测序下了机器，别急着跑Space Ranger。先看几个关键指标：
- 有效barcode比例：低于70%说明透化效率有问题，或者玻片有污染。
- 测序饱和度：超过80%说明测序深度足够了，低于40%建议补测。
- 比对率：小鼠样本应>80%，人样本>85%。低于这个数，要么是样本污染，要么是参考基因组版本不匹配。
- UMI中位数/spot：一般要求>1,000 UMI/spot。如果大部分spot低于500，那空间解析度就基本没戏了。
# Space Ranger 输出的关键质检指标摘录（一个理想样本）
Estimated Number of Cells: 3,206
Mean Reads per Cell: 42,153
Median UMI Counts per Cell: 4,612
Median Genes per Cell: 1,875
Fraction Reads in Spots: 0.967
Fraction of Spots Under Tissue: 0.843
Sequencing Saturation: 0.714嗯，你会注意到我特别关注“Fraction of Spots Under Tissue”这个值。低于0.7意味着很多捕获区域根本没组织覆盖，白白浪费了测序量。这种事我遇到过几次，后来用显微镜拍照时强制加一个组织边缘的荧光标记，贴片的位置就控制得准多了。