2. Visium 技术原理：10x Visium 平台的工作流程
很多人第一次接触空间转录组，都会问：「这玩意儿到底是怎么把基因和位置绑在一起的？」
我第一次看到Visium的数据时，也愣了半天。一块组织切片上，每个点都有几千个基因的表达量，还能在显微镜下看到细胞形态。说实话，这技术确实有点意思。
2.1 捕获区：一块芯片的核心
Visium的核心，是一块特制的玻片。这块玻片上印着成千上万个捕获点。
每个捕获点直径55微米，中心距100微米。你想想看，1平方毫米的面积上，大概有100个这样的点。整个捕获区（6.5mm × 6.5mm）能覆盖大约5000个点。
每个点上，都固定着带有空间条形码（Spatial Barcode）的探针。这个探针长这样：
5' - 捕获序列 - UMI - 空间条形码 - Poly(dT)VN - 3'几个关键组件：
- Poly(dT)VN：抓取mRNA的尾巴。所有真核生物的mRNA都有poly-A尾，它就靠这个把mRNA钓上来。
- 空间条形码：每个捕获点独有的编号。我习惯把它叫做「坐标指纹」。
- UMI：唯一分子标识符。用来去重，避免PCR扩增带来的偏差。
- 捕获序列：用于后续文库构建的通用序列。
2.2 完整工作流程：从组织到数据
整个流程可以分为五步。我画了一张图，你看一遍就能记住：
2.3 第一步：组织切片与染色
首先，你要把组织样本冷冻在OCT里，然后切成10微米厚的薄片。
这个厚度是经过优化的。太薄了，细胞不完整；太厚了，RNA透化不充分。我在项目里试过15微米，结果背景噪音大得没法看。
切片贴到Visium玻片上后，要先做HE染色（苏木精-伊红染色），然后拍照。这张照片就是后续所有分析的位置参考。
2.4 第二步：透化与mRNA捕获
这是整个流程中最关键的一步。
你需要用蛋白酶K处理组织，让细胞膜产生孔洞，释放出mRNA。这些mRNA会扩散到下方的捕获点上，被Poly(dT)探针抓住。
透化时间直接影响数据质量。时间太短，mRNA出不来；时间太长，mRNA会扩散到相邻的捕获点，造成空间特异性丢失。
10x官方推荐的做法是：先做透化时间梯度测试。具体参数：
| 步骤 | 试剂 | 时间 | 温度 |
|---|---|---|---|
| 透化 | 蛋白酶K（1:100） | 5-30分钟（需优化） | 37°C |
| 逆转录 | 逆转录酶+ dNTPs | 45分钟 | 53°C |
| 组织消化 | 蛋白酶K + SDS | 30分钟 | 56°C |
嗯，这里有个细节：逆转录是在玻片上原位进行的。cDNA合成后，mRNA模板会被RNase H降解掉，但cDNA因为共价结合在捕获点，不会被洗掉。
2.5 第三步：组织移除与cDNA释放
原位逆转录完成后，接下来要用强蛋白酶消化掉组织。这一步的目的是把组织彻底去除，只留下固定在捕获点的cDNA。
处理完后，玻片上只剩下一堆「小圆点」——每个圆点代表一个捕获位置，上面挂着带有空间条形码的cDNA片段。
2.6 第四步：文库构建
从玻片上把这些cDNA洗脱下来，然后进行标准的Illumina文库构建。流程如下：
- 第二链合成：用随机引物把cDNA变成双链。
- cDNA扩增：PCR扩增，增加总量。我一般做14-16个循环，具体看起始量。
- 酶切片段化：用Tn5转座酶把cDNA切碎，同时加上测序接头。
- 终文库PCR：加上P5/P7接头和样品index。
- 片段筛选：用磁珠筛选300-600 bp的片段。
构建好的文库，结构大概是这样：
P5 - 空间条形码 - UMI - cDNA插入片段（~300-600 bp） - P72.7 第五步：测序与数据产出
Visium文库推荐用Illumina NovaSeq 6000测序，双端150 bp。具体的读段分配如下：
| 读段 | 读取内容 | 长度 |
|---|---|---|
| Read 1 | 空间条形码 + UMI | 28 bp |
| Read 2 | cDNA插入片段 | 150 bp |
| i7 Index | 样品标签 | 10 bp |
测序完成后，你会得到两个主要文件：
- FASTQ文件：Read 1（28 bp含条形码）和Read 2（150 bp含转录本序列）。
- HE染色图像：用于后续对齐空间位置。
再往后，就要用10x官方的 Space Ranger 软件来处理这些数据了。不过，那是下一章的事儿，这里先不展开。
简单总结一下：Visium的核心，就是把「基因表达」和「空间位置」通过一块印着条形码的玻片绑在了一起。流程不复杂，但每一步的质控都很关键。尤其是透化这一步——我见过太多的数据废在透化时间没选好上。