第4章 数据预处理：质量控制、标准化、高变基因选择

数据预处理这一步，说白了就是给后面的分析“打好地基”。我刚开始做空间转录组项目时，总觉得数据拿到手直接跑聚类就完事了，结果跑出来的聚类结果一团糟——后来才明白，前处理没做好，后面再怎么调参数也是白费力气。咱们这一章就把 QC、标准化、高变基因选择这三个关键步骤拆开来讲，每一步我都会结合自己的踩坑经验给你说透。

4.1 为什么预处理这么关键

空间转录组数据有个特点：不仅维度高（几万个基因），还有空间坐标信息。如果原始数据里混着太多空液滴或死细胞，聚类结果就会把噪声当成真实信号。你想想看，一个只有20个UMI的点，它连基本的表达量都测不准，怎么能用来识别空间域？我个人的习惯是，预处理花的时间至少要占整个分析流程的30%，后面才能少走弯路。

咱们要做的三件事其实是一条流水线：

  1. 质量控制：剔除低质量的空间点（spots）
  2. 标准化：消除测序深度、点大小等技术偏差
  3. 高变基因选择：只保留信息量最大的基因用于聚类
个人经验：我在10x Visium数据上试过跳过标准化直接跑BayesSpace，聚类结果里出现了明显的批次效应——每个样本都聚到自己的区域里去了。所以这三步，一步都不能省。

4.2 质量控制（QC）

QC的核心目标就是识别并过滤掉“坏点”。空间转录组的每个点相当于一个“微组织样本”，它可能会因为组织褶皱、气泡、切片残片等原因质量很差。我常用的几个指标如下：

指标典型阈值说明
UMI计数（nCount）500 ~ 20000（视组织类型调整）太低可能是空液滴，太高可能是重叠组织
检测基因数（nFeature）300 ~ 6000低于300可能是空点，高于6000可能带气泡
线粒体基因比例（percent.mt）< 20%超过20%提示细胞/组织可能已受损

实际做的时候，我会先用散点图把这三个指标的分布画出来，手动选一个“拐点”作为阈值。记住：没有一劳永逸的固定阈值，每个数据集都有自己的脾气。

# Seurat 中常用的QC代码片段（以空间数据为例）
library(Seurat)
library(SeuratData)

# 创建Seurat对象
st <- Load10X_Spatial("path/to/spatial/")

# 计算线粒体比例
st[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(st, pattern = "^MT-")

# 可视化QC指标
VlnPlot(st, features = c("nCount_Spatial", "nFeature_Spatial", "percent.mt"),
        ncol = 3, pt.size = 0)

# 过滤
st <- subset(st, subset = nFeature_Spatial > 300 & 
             nFeature_Spatial < 6000 & 
             percent.mt < 20)
我曾经踩过的坑：有一次我用默认阈值（nFeature > 200）过滤一个高密度的肿瘤样本，结果保留了至少30%的空点，聚类后出现了大片“假区域”。后来把阈值提高到500，那些空点才被剔除干净。所以，强烈建议先可视化再定阈值，而不是直接套用别人的数字。

4.3 标准化

标准化要解决一个现实问题：不同空间点的测序深度可能差很大（比如有的点跑了5000 UMI，有的只有1000）。如果不做标准化，高深度点会被当成高表达，这显然不合理。

空间转录组最常用的标准化方法有：

  • LogNormalize：每个点的UMI除以该点总UMI，再乘以缩放因子（默认10000），最后log1p。
  • SCTransform：基于正则化负二项回归，效果更好，但计算量大。
  • BayesSpace 自己的预处理：它推荐先用log(counts + 1)做简单标准化，再配合其内置的马尔可夫随机场建模。

我个人在BayesSpace流程中通常这样操作：

# 用 Seurat 完成标准预处理
st <- NormalizeData(st, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
st <- FindVariableFeatures(st, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
st <- ScaleData(st)
# 这里ScaleData会把数据缩放到均值为0、方差为1，便于后续降维
关键注意点：BayesSpace的输入要求是经过log标准化的表达矩阵（不能是原始counts），而且最好是没有经过ScaleData的——因为BayesSpace会自己处理空间相关性。所以如果你用Seurat做预处理，只要运行到NormalizeData和FindVariableFeatures即可，千万不要ScaleData。我当初就是忘了这一点，导致BayesSpace一直报错，排查了半天才发现问题。

4.4 高变基因选择

空间转录组数据通常检测到1~2万个基因，但其中大部分基因在点之间的表达变化很小，它们对区分空间域没有贡献。高变基因选择就是挑出那些“表现最活跃”的基因——它们在空间点上的表达水平波动最大。

常用方法有：

  • 方差稳定变换（vst）：Seurat默认方法，拟合基因均值-方差关系，挑选标准化后方差最大的基因。
  • mean.var.plot：Seurat旧版方法，基于平均表达和方差绘制散点图。
  • dispersion-based：基于离散度（如TPM高表达时方差更大）。

我一般选2000个高变基因，如果组织类型很单纯（比如正常脑组织），1500个也够；如果是肿瘤异质性很强的样本，可以加到3000个。选择太多会把噪声带进来，太少又会丢失信息。

# Seurat 中直接运行
st <- FindVariableFeatures(st, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# 查看挑选的基因
top10 <- head(VariableFeatures(st), 10)
print(top10)

# 可视化高变基因
VariableFeaturePlot(st)
一个实用的检查方法：高变基因列表里有没有线粒体基因？如果MT-CO1这类基因排在前列，说明你的QC可能没做好，组织损伤严重。这时候要回去检查percent.mt的阈值，而不是继续往下做。

4.5 数据预处理流程概览

为了让你对整个流程有更直观的理解，我画了一张流程图，把三步串联起来：

空间转录组数据预处理流程 原始表达矩阵 质量控制 标准化（log转换） 高变基因选择 PCA / BayesSpace ⚠ 重要提醒： 高变基因列表里若线粒体基因为主， 说明QC不到位，需要返回调整。

可以看到，从原始数据到最终用于聚类的特征矩阵，每一步都有明确的输入和输出。我个人习惯是把这份流程固化成一个脚本，每次跑新数据前先跑一遍QC诊断图，确认无误后再走标准化和高变基因选择，这样能避免很多后期返工。

总结三条铁律：
  1. QC阈值必须基于数据可视化手动确定，别用默认值。
  2. 标准化用log转换即可，不要额外做ScaleData（除非你知道自己在做什么）。
  3. 高变基因数量控制在1500~3000，优先检查线粒体基因占比。

做好了这三步，你的数据就已经准备好了。下一阶段我们就可以用它来运行BayesSpace的空间聚类算法了。不过在那之前，我建议你先拿这一套预处理流程跑一个简单的实例，感受一下每个参数变化对结果的影响——有时候“坏点”被过滤后，聚类的轮廓会变得清晰得多。

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