3. 空间转录组数据格式：ST、Visium、Slide-seq、MERFISH

做空间聚类，第一步就是跟数据格式打交道。不同平台产出的数据，结构差异很大。你拿Slide-seq的格式去跑Visium的流程，准报错。我入行头半年就犯过这个错——拿Visium的代码直接读Slide-seq的bead数据，结果解析出来的坐标全是NaN，折腾了两天才发现是格式不兼容。

这一章咱们把四种主流格式掰开看：ST、Visium、Slide-seq、MERFISH。我会结合项目踩坑经验，帮你理清每种格式的核心字段、存储结构，以及对应的空间聚类适配要点。

3.1 ST 格式（空间转录组学第一代）

ST（Spatial Transcriptomics）是2016年推出的原位捕获技术。它的数据格式比较原始——说白了就是一张高分辨率的组织切片图，加上一个手动分割的网格坐标文件。

典型的ST数据包含两个核心文件：

  • 组织图像（.tif或.png）：高分辨率H&E染色图，用于定位点阵。
  • 坐标文件（.txt或.csv）：每行一个spot，包含列名如 x_pixel, y_pixel, tissue_flag。

每个spot直径约100μm，中心间距200μm。圈出来的点阵通常对应图像上的特定区域。我最早处理ST数据时，最头疼的是手工对齐——图像旋转了0.5度，坐标就全偏了。后来我写了个脚本用图像配准做了自动校正，才解放了双手。

# ST 坐标文件示例
spot_id  x_pixel  y_pixel  tissue_flag
spot_01  120.5    340.2    1
spot_02  320.8    341.1    1
spot_03  120.3    540.6    0

ST格式的基因表达矩阵通常按spot×gene存储，行名对应spot ID，列名是基因名。它和Visium最大的区别是没有条形码（barcode）字段——spot的标识就是手动命名的字符串。

注意：ST原始数据中的 tissue_flag=0 代表该spot在组织外，空间聚类前必须过滤掉。我见过有人忘记过滤，聚类结果把背景区域也聚成一类，还得回炉重做。

3.2 Visium 格式（10x Genomics 的进化版）

Visium是10x Genomics在2019年推出的升级版。它继承了ST的网格思想，但做了标准化：每个spot直径55μm，中心间距100μm，密度翻了近4倍。最关键的是——每个spot带了唯一的条形码（barcode），读取可以直接通过barcode匹配到空间位置。

Visium的标准输出是H5文件（Space Ranger流程生成）和三个辅助文件：

  • filtered_feature_bc_matrix.h5：基因表达矩阵，HDF5格式，包含barcode、feature（基因）和计数。
  • tissue_positions_list.csv：四个字段：barcode、in_tissue、row、col（行列索引）以及像素坐标（pxl_row_in_fullres, pxl_col_in_fullres）。
  • scalefactors_json.json：图像缩放参数，用于对齐坐标。
  • tissue_hires_image.png：高通量组织图像。
# tissue_positions_list.csv 片段
barcode,in_tissue,array_row,array_col,pxl_row_in_fullres,pxl_col_in_fullres
AAACCCAAGATATGCT-1,1,0,0,112.5,98.3
AAACCCACAGTGACTT-1,1,0,1,212.7,99.1
AAACCCAGTATTACGG-1,0,1,0,113.0,198.5

Visium的坐标系统是统一的——每个capture area有固定尺寸（6.5mm × 6.5mm），包含4992个spot（其中大约3500-4000落在组织内）。

小技巧：读Visium数据建议直接用 scanpy.read_visium()，它会自动解析H5和CSV文件。我之前手写解析踩了图像缩放的坑——原始像素坐标是fullres级别的，如果不乘以scalefactors，坐标范围会差好几倍。

3.3 Slide-seq 格式（高分辨率的“球”时代）

Slide-seq是Broad Institute开发的基于DNA条形码球形微珠（bead）的方法。它的分辨率远高于Visium——单个bead直径10μm，中心间距约20μm。每个bead携带一个唯一的DNA条形码（barcode），用来标记空间位置。

Slide-seq的数据格式很特别：

  • 表达矩阵：bead × gene，稀疏矩阵（通常用mtx格式或h5ad）。
  • bead坐标文件（.csv或.tsv）：每个bead的三维坐标（x, y, z）以及对应的barcode。注意：z坐标通常是0（因为切片是2D），但有些版本会有小范围的高度变化。
  • meta文件：包含bead的测序质量、组织归属标记。

我处理Slide-seq数据时最头疼的是坐标精度——Visium的阵列坐标是整数（row, col），而Slide-seq的真实坐标是连续浮点数，且由于制造工艺，bead位置会有±5μm的随机偏移。如果你直接做网格划分，很容易把近邻的bead分到不同格子里。

# Slide-seq 坐标文件示例 (beads.csv)
barcode,x,y,z
CGTACGAT-1,102.34,88.72,0.00
ACTGAGTA-2,104.56,89.04,0.00
TGACATCG-3,98.12,87.90,0.00

Slide-seq的另一个特点是数据稀疏——每个bead通常只捕获几十到几百个基因，而Visium每个spot能测到数千个。所以在做空间聚类前，我习惯先用k近邻计算bead之间的空间权重矩阵，再用BayesSpace的增强模型处理稀疏性。

3.4 MERFISH 格式（单细胞分辨率的多重成像）

MERFISH（Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization）是单细胞分辨率的技术——每个细胞可被独立分辨，而不是像前三种那样依赖固定网格。它的数据格式更像单细胞RNA-seq，但多了一组空间坐标。

MERFISH的典型数据包含：

  • 细胞分割掩膜（.tif或分水岭结果）：每个细胞的轮廓多边形。
  • 表达矩阵（cell × gene）：每个细胞中每个基因的RNA计数。
  • 细胞质心坐标（.csv）：每个细胞的中心点位置（x, y，有时包括z）。
  • 细胞形态学特征：面积、周长、圆形度等，用于质量控制。
# MERFISH 细胞坐标示例
cell_id,center_x,center_y,area,p_ratio
cell_001,120.5,340.2,135.6,0.78
cell_002,320.8,341.1,142.3,0.81
cell_003,120.3,540.6,98.7,0.65

MERFISH的坐标直接对应细胞质心，不需要从网格映射。看起来简单，但有个坑：细胞分割的精度直接影响聚类质量。我曾在MERFISH数据上做过一次空间聚类，结果发现几个“细胞”其实是死细胞碎片——分割算法把碎片当成了细胞，导致聚类结果中出现一堆很小的异常簇。后来我加了面积和圆形度过滤（p_ratio < 0.5的扔掉），才得到干净的聚类结果。

核心区别总结：
  • ST/Visium：网格点阵，每个spot混合多个细胞，适合组织区域剖析。
  • Slide-seq：高密度珠粒，接近单细胞分辨，数据稀疏。
  • MERFISH：真正的单细胞分辨，坐标来自细胞质心，但依赖分割精度。

3.5 四种格式的对比与BayesSpace适配

BayesSpace虽然最初是为ST和Visium设计的，但经过改进后可以兼容Slide-seq和MERFISH。关键是提供合适的空间邻接矩阵和坐标系统。下表总结了四种格式的关键属性和BayesSpace适配要点：

属性STVisiumSlide-seqMERFISH
分辨率100μm spot55μm spot10μm bead单细胞
坐标来源手动/图像对齐阵列行列+像素连续坐标（μm）质心坐标（μm）
基因数/位点~500-1000~2000-5000~100-500~10000
数据稀疏性低中高低
BayesSpace适配直接支持直接支持需构建KNN图需构建细胞邻接图

我记得处理一个Slide-seq数据集时，因为bead之间距离不均匀，直接用固定半径邻接矩阵效果很差。后来我改用自适应KNN（k=10），让每个bead只连接最近的10个邻居，BayesSpace聚类才收敛。

实操建议：
  1. Visium数据直接用 BayesSpace::readVisium()。
  2. Slide-seq先读入坐标，用 dbscan::kNN() 构建邻接矩阵，再转为 SpatialExperiment 对象。
  3. MERFISH数据注意过滤低质量细胞（面积<50μm²或p_ratio<0.5的剔除）。

3.6 知识结构图：四种格式的核心处理流程

下面这张图梳理了四种格式从原始数据到BayesSpace输入的关键流程。你理解清楚这个框架，后续章节的聚类实战就会顺畅很多。

四种空间转录组数据格式与BayesSpace适配流程 ST Visium Slide-seq MERFISH 图像配准+网格坐标 H5读取+像素缩放 连续坐标+KNN邻接 细胞分割+质心过滤 SpatialExperiment 坐标矩阵 表达矩阵 邻接矩阵 图像元数据 BayesSpace 空间聚类 降维可视化 区域标注 差异表达 注意：ST和Visium可直接用BayesSpace内置函数构建邻接矩阵；Slide-seq和MERFISH需要自行构建空间邻接关系

这张图展示了从四种原始数据格式，到中间预处理（坐标对齐/缩放/分割过滤），再到构建统一的SpatialExperiment对象，最后送入BayesSpace进行聚类的完整思路。你在实战中可以直接套用这个框架——改动的只是读入和预处理部分的代码。

好了，空间转录组的数据格式就聊到这。你得把这些格式的差异刻在脑子里——后续几章我们会用真正的代码把每种格式的数据喂给BayesSpace，到时候你就知道哪种预处理最省心了。

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