3. 质量控制（QC）：FastQC 软件安装与质量评估指标解读

拿到原始测序数据，第一步不是直接往下游分析。你得先问问自己：这批数据质量到底怎么样？我见过太多人上来就跑比对，结果跑完一看 mapping rate 惨不忍睹，回头才发现是接头残留太多。所以，质量控制就是整个 RNA-seq 分析的生命线。这一章，我们就来搞定 FastQC——最常用的质控工具，以及怎么读懂它那十几张图表。

3.1 先装好 FastQC

安装其实很简单。FastQC 是基于 Java 的，所以你需要先确认机器上有 Java 运行环境。我个人习惯把它装在 /opt 或者 /usr/local 下面，方便团队共享。

下面是我常用的安装步骤，适用于 Linux 和 macOS。Windows 用户直接去官网下载图形版即可，但命令行版在 WSL 下也很香。

# 下载（版本号以官网最新为准）
wget https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.12.1.zip

# 解压
unzip fastqc_v0.12.1.zip

# 进入目录
cd FastQC

# 给执行权限
chmod +x fastqc

# 添加环境变量（写入 ~/.bashrc 或 ~/.zshrc）
echo 'export PATH=$PATH:/path/to/FastQC' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc

# 测试安装
fastqc --version

Tip：如果你用 conda，更简单：conda install -c bioconda fastqc。但有时 conda 版本会比较旧，我倾向于手动安装最新版，尤其当遇到新 Illumina 平台的数据时。

3.2 运行一次质控

安装完就跑一下试试。假设你的数据是双端测序（PE），两个文件分别是 sample_R1.fastq.gz 和 sample_R2.fastq.gz。

# 基本用法
fastqc sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz -o ./qc_results

# 建议多加几个线程提速
fastqc -t 4 sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz -o ./qc_results

# 如果想看所有支持的参数
fastqc --help

运行完后，会在 ./qc_results 目录下生成一个 HTML 报告和一个个 .zip 文件。HTML 可以直接用浏览器打开，里面就是所有质量评估的图表。嗯，这里要注意，FastQC 默认是用 Java 的图形界面渲染报告的，但我们现在要的是纯文本和图表分析，HTML 报告就是最好的交互式浏览方式。

3.3 读懂 FastQC 报告——十个核心指标

FastQC 报告分了十几个模块，但你不需要每个都深究。我把最重要的几个拿出来讲，剩下的能看懂最好，看不懂也别慌。

模块名称 含义 红灯信号 我的经验
Basic Statistics 总 reads 数、总碱基数、GC 含量、序列长度分布 长度不一致（非预期）、GC 偏离理论值过远 曾经有一次发现 GC 含量高达 70%，后来发现是 rRNA 污染
Per Base Sequence Quality 每个碱基位置的质量分数箱线图 某段区域质量低于 Q20（红色区域） 双端测序的 Read 2 末端经常掉质量，正常现象，但掉太狠就要考虑截断了
Per Sequence Quality Scores 每条 read 的平均质量分布 主峰低于 Q28 如果整体质量偏低，可能是文库有问题，或者测序仪老化了
Per Base Sequence Content 每个碱基位置四种碱基的比例 前几个碱基出现明显波动（不是 AT/GC 互补） 接头残留、引物偏差都在这儿现原形
Per Sequence GC Content 每条 read 的 GC 含量分布曲线 多峰或偏离理论分布 污染、文库扩增偏好都会导致 GC 分布异常
Sequence Duplication Levels 重复序列比例 >30% 的 reads 出现重复（尤其 RNA-seq） RNA-seq 中低表达基因会有一些 PCR 重复，但过高就要警惕文库扩增过度
Overrepresented Sequences 出现频率异常高的序列列表 出现已知接头、rRNA、tRNA 等 最常见的坑：接头没完全切除，或者样本污染了
Adapter Content 接头污染各位置累计比例 >0.1% 且呈上升趋势 直接告诉你该做 adapter trimming 了
Per Base N Content 每个位置 N（未识别碱基）的比例 >5% 且集中在某一端 一般是 read 末端测序质量太差，机器认不出来
Sequence Length Distribution reads 长度分布情况 非单峰或不匹配预期长度 如果是 SMARTer 等全长文库，长度分布能反映完整性

Warning：别只看 Green/Red 的 PASS/WARN/FAIL。FastQC 的阈值是通用型，RNA-seq 的重复率本来就比 WGS 高，所以 Sequence Duplication 经常显示 FAIL，这不一定是坏事。关键要结合你的样本类型和数据来源判断。

3.4 一张图看懂 QC 流程

下面这张 SVG 图总结了一个典型的 RNA-seq 质量控制的整体逻辑。你可以把它当作一个检查清单，每次跑完 FastQC 都对照着看一遍。

RNA-seq 质量控制核心流程 RNA-seq 质量控制核心流程图 原始 FASTQ 数据 运行 FastQC Per Base Quality 评估 Adapter / 污染检测 质量 OK? 有接头? Trimming / 截断 Adapter 切除 干净数据 → 下游分析 💡 循环：切完后建议再跑一次 FastQC，确认问题已解决再往下走

3.5 常见问题与应对策略

你想想看，FastQC 报告里那些红色警告到底该怎么处理？我根据多年经验，把几个高频场景列了出来。

  • Per Base Quality 末端下降严重：用 cutadapt 或 Trimmomatic 做滑动窗口截断（sliding window trimming）。我习惯设窗口 4bp，平均质量 > Q20 保留，否则切掉。
  • Adapter Content 超过 5%：必做 adapter trimming。建议用 cutadapt -a AGATCGGAAGAGC ... 或者直接上 fastp 一条命令搞定。
  • Overrepresented Sequences 包含 rRNA 序列：说明样本中有核糖体 RNA 残留。如果做的是 polyA 富集文库，这是不正常的；如果是 rRNA 去除文库，残留少量也正常，但太多会影响比对效率。你可以考虑用 bowtie2 把 rRNA reads 过滤掉。
  • Sequence Duplication Levels 曲线异常高：检查是不是低复杂度文库（比如 miRNA-seq）或者 PCR 扩增 cycle 太多。RNA-seq 中，高表达基因的重复是生物学性的，不必全部去除，但可以用 umi-tools 或 Picard MarkDuplicates 标记一下。

重点：质量控制不是一次性的，而是迭代的。处理一步，重新跑一次 FastQC，直到所有红灯都变成绿灯（或者你能解释为什么是红灯）。我曾经有个项目，切了三次接头才把 Adapter Content 降到 0.1% 以下，多跑一次 FastQC 永远不亏。

3.6 批量化处理小技巧

单个样本用 FastQC 没问题，但一个项目动辄几十上百个样本，一条条跑岂不累死？写个循环或者直接用 fastqc *.fastq.gz 通配符即可。我更喜欢用 parallel 来并行，节约时间。

# 所有样本统一输出到 qc_raw 文件夹
mkdir -p qc_raw
fastqc -t 8 data/*.fastq.gz -o qc_raw/

# 然后可以用 MultiQC 汇总所有样本的报告
multiqc qc_raw/ -o multiqc_report/

MultiQC 会把所有 FastQC 报告整合成一个交互式页面，还能展示样本间的横向对比。说实话，MultiQC 是我最爱的工具之一——它一下子就能看出哪个样本质量最差，哪个批次有系统性偏差。

3.7 我踩过的那些坑

  1. 忽略 FastQC 的压缩格式警告：有时候数据是 .gz 但文件名后缀不标准，FastQC 会报错。解决办法是标准化命名：rename 's/\.fastq$/\.fastq.gz/' *.fastq（前提是确实是压缩的）。
  2. 只看 Per Base Quality 的箱线图，没看 Per Sequence Quality Scores：箱线图显示前 100bp 质量很好，但 Per Sequence Quality Scores 却显示大量 reads 平均质量差。为什么？因为有些 read 整条都差，但混合在好 reads 里被平均掉了。所以两个图要一起看。
  3. 把 adapter contamination 当成了真实序列：有一次我在 Overrepresented Sequences 里看到一段序列，以为是什么 novel 转录本，后来一查是 TruSeq 的索引接头。所以建议你先看看那个 Overrepresented Sequences 的备注列，FastQC 会帮你 match 已知接头。

Warning：千万不要在没做质控和清洗的情况下直接跑比对。mapping rate 低是小事，更可怕的是错配——比如 adapter 残留会导致大量 reads 比对到基因的 3' 端附近，产生假的差异表达基因。这锅你背不起。

好了，质量控制这部分就讲到这里。你拿到真实数据后，先按我上面的步骤跑一次 FastQC，然后对照着那张表格和流程图，把每个指标过一遍。做到心中有数，再放心往下走。

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