第2章 数据获取与格式：FASTQ格式、公共数据库（SRA/GEO）使用

好，聊完了RNA-seq的整个实验设计和基本原理，咱们得着手搞数据了。这一章，我带你看看最原始的数据长什么样，以及怎么从公共数据库里把它们扒下来。说实话，这一步要是搞错了，后面分析得再好也是白搭。

2.1 FASTQ格式：测序仪吐出来的“原始密码”

你从测序仪或者公共数据库下载下来的，多半是FASTQ文件。这个格式，说白了就是测序仪直接把读到的一堆DNA小片段，加上对应的质量分数，打包成文件扔给你。

FASTQ 文件里记录的是 序列（Sequence） 和 质量（Quality）。序列就是ATCG的排列组合，质量则记录了每个碱基被测序仪读错的概率。

2.1.1 FASTQ的“四行一条”结构

每个read在FASTQ文件中占4行，这是铁律。你随便打开一个看，结构都一模一样。

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG
CTTCACAAAATCCTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTC
+
;;C;;F;;FFF:FF::FFF:::FFFFF:F:FFCF:FFFF:F:FFFFFFFFFF:FFF:FFFFCFFFFF

第一行以 @ 开头，是读段的标识符，包含仪器ID、流动槽位置、坐标等信息。第二行是碱基序列。第三行是一个 +，后面可以跟描述信息（但通常为空）。第四行是质量分数，每个字符对应第二行每个碱基的质量。

质量分数怎么算？

第四行的每个字符通过ASCII码映射成一个数值，再经过一定的公式转换，就得到了这个碱基的 Phred Quality Score（Q值）。

• Q = -10 log10(P)，P是这个碱基测错的概率。
• Q = 30，意味着测错概率是千分之一（P = 0.001），准确率99.9%。
• Q = 20，意味着测错概率是百分之一（P = 0.01），准确率99%。

2.1.2 用命令行看一眼FASTQ

在Linux环境下，我习惯用 less 或者 zcat 直接看压缩文件。但是千万别直接打开整个文件，会卡死。

# 查看压缩的FASTQ文件前8行（即前2条read）
zcat sample_R1.fastq.gz | head -n 8

# 查看共有多少条read
zcat sample_R1.fastq.gz | echo $((`wc -l` / 4))

# 或者直接用seqkit统计
seqkit stat sample_R1.fastq.gz

2.2 公共数据库：SRA和GEO的用法

你自己做实验拿到了数据，或者想用别人的数据练手，都得去公共数据库。环境里最常用的两个库：SRA（Sequence Read Archive） 和 GEO（Gene Expression Omnibus）。

有什么区别？

简单来说，SRA是存原始测序数据的“仓库”，而GEO是存处理后的表达矩阵和元数据的“档案馆”。你想下载原始FASTQ文件，就去SRA；你想看别人分析好的基因表达表、差异基因列表，就去GEO。

2.2.1 从SRA下载原始数据：SRP、SRR、SRA Toolkit

我刚开始用SRA时，被那一串编号搞晕过。简单梳理一下：

• SRP (SRA Project)：对应一个研究项目，比如“某某癌细胞系RNA-seq”。
• SRS (SRA Sample)：对应一个生物学样本。
• SRR (SRA Run)：对应具体的测序数据文件，一个样本可能有多个SRR（比如双端测序的两个文件）。

下载数据，需要用到官方的工具 SRA Toolkit。

# 安装SRA Toolkit (Ubuntu)
conda install -c bioconda sra-tools

# 或者下载源码安装
wget https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/current/sratoolkit.current-ubuntu64.tar.gz
tar -vxzf sratoolkit.current-ubuntu64.tar.gz
# 然后添加到环境变量PATH

下载的核心命令是 fastq-dump 或者更好用的 fasterq-dump。

# 用fastq-dump下载一个SRR文件，默认生成单个FASTQ文件
fastq-dump SRR12345678

# 下载双端测序数据，生成_R1和_R2两个文件
fastq-dump --split-files SRR12345678

# 推荐用fasterq-dump，速度更快，支持线程
fasterq-dump --split-files --threads 8 SRR12345678

vdb-config --interactive  # 或者直接接受默认设置：vdb-config -s

2.2.2 从GEO挖掘元数据

SRA只管原始数据，但你想知道样本是怎么处理的、用了什么细胞系、分组信息，这些得去GEO找。GEO的核心编号是 GSE (GEO Series) 和 GSM (GEO Sample)。

我教你一个快速抓取元数据的方法。GEO的官网支持直接下载处理后的数据（通常是表达矩阵），而且有个SOFT格式文件，里面包罗万象。

# 下载GSE的SOFT格式文件（包含所有样本信息和平台信息）
wget "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE123456&targ=self&form=text&view=full" -O GSE123456_soft.txt

# 或者用R包GEOquery
# 在R中运行
library(GEOquery)
gse <- getGEO("GSE123456", destdir=".")
# 提取表达矩阵
exprs_data <- exprs(gse[[1]])
# 提取样本元数据
pdata <- pData(phenoData(gse[[1]]))

2.3 总结：拿到数据后的第一件事

好了，你现在知道数据从哪里来、长什么样了。我建议你拿到任何RNA-seq数据后，先做这三件事：

1. 肉眼检查：用 zcat | head 看看格式对不对，特别是质量分数那行。
2. 统计质量：跑 fastqc，生成初步的质量报告。
3. 清洗元数据：整理出样本名称、分组、实验条件，做成一个清晰的CSV表格。