📚 课程目录第4章高通量测序数据生成与质控

4. 高通量测序数据生成与质控

在临床多组学整合工程中，测序数据是后续变异检测、表达定量、融合基因识别乃至报告解读的原始输入。不同测序策略产生的数据在结构、覆盖特征、噪声来源和适用场景上差异显著，因此理解WGS、WES、RNA-seq的生成原理与质控要点，是保证下游分析可靠性的第一道关口。本节围绕“数据怎么来、质量怎么看、异常怎么滤”三个层面展开，并以一批临床样本的质控实战为例，说明FastQC与MultiQC的联合使用方式。

一、三类测序策略的生成逻辑与临床定位

WGS（全基因组测序）对基因组进行较均匀的随机打断和全范围测序，覆盖核基因组及部分线粒体基因组。其优势在于可同时检测SNV、InDel、CNV、结构变异和线粒体变异，适合不明原因罕见病、复杂结构变异、肿瘤突变负荷评估等场景。临床WGS常用30×左右深度，若需检测低比例嵌合或肿瘤亚克隆，可提升至60×～100×。其代价是数据量大、存储与计算成本高，且对重复区域和高度同源区的比对仍存在挑战。

WES（全外显子组测序）通过探针捕获外显子及部分剪接边界区域，仅对蛋白编码区进行富集测序。临床常用目标深度为100×～200×，以弥补捕获不均带来的覆盖波动。WES适合孟德尔遗传病、肿瘤驱动基因筛查和成本受限的大队列研究，但对深内含子、调控区、线粒体及大片段CNV的检测能力有限，且捕获效率直接影响目标区覆盖均一性。

RNA-seq（转录组测序）以RNA反转录后的cDNA为测序对象，反映样本在特定状态下的基因表达、可变剪接和融合转录本。临床常用于肿瘤融合基因检测、表达分型、免疫微环境评估及未知融合伴侣探索。其质控重点与DNA测序不同：需关注rRNA残留、文库链特异性、3′/5′偏好性、重复序列比例以及样本降解程度。若目标是融合检测，还需关注读长、双端测序和比对策略对嵌合读段的支持能力。

二、FastQC：单样本质量画像的读取方式

FastQC对FASTQ文件逐样本生成HTML报告，核心模块包括Per base sequence quality、Per sequence quality scores、Per base sequence content、Per sequence GC content、Sequence duplication levels、Adapter content和Overrepresented sequences。临床数据判读时，不应只看“是否全绿”，而要结合测序类型和样本来源理解异常模式。

例如，DNA测序中若Per base sequence quality在末端出现明显下降，常见原因是测序周期末端的荧光信号衰减或簇密度过高；若Adapter content在3′端升高，提示插入片段偏短或接头去除不彻底。RNA-seq中若Per base sequence content前几位出现剧烈波动，通常与随机引物偏好有关，属于可接受现象；但若Sequence duplication levels异常高，则需警惕rRNA残留或低复杂度文库。GC分布出现双峰时，DNA样本可能提示污染或杂合缺失，RNA样本则可能与rRNA残留或降解相关。

需要强调的是，FastQC的“警告”和“失败”并非绝对阈值，而是提示需要结合实验背景判断。例如，WES的捕获区域本身GC含量不均，Per base sequence content出现波动可能属于正常；而肿瘤样本的重复率偏高，也可能反映肿瘤纯度或拷贝数异常。因此，质控报告必须与样本类型、建库方式和目标应用联合解读。

三、MultiQC：多样本横向比较与批次识别

当一批临床样本同时进入分析流程时，单样本FastQC报告难以快速发现批次效应和离群样本。MultiQC可自动扫描目录下的FastQC zip文件、Trimmomatic日志、fastp JSON、Samtools stats等，生成一份汇总HTML报告。其核心价值在于：把每个样本的Q30比例、GC含量、重复率、接头比例、过滤后reads数等指标并排展示，便于识别异常样本。

在临床实战中，建议重点关注以下横向指标：

Q30比例：DNA测序通常要求≥85%，RNA-seq可略低，但若低于80%需排查测序质量或过滤参数。
GC含量：同一批次样本GC分布应相对集中，若某样本明显偏移，可能提示污染、降解或物种来源异常。
重复率：WGS通常低于20%，WES因捕获区域有限可略高，RNA-seq受表达丰度影响可更高，但需与rRNA残留区分。
过滤后reads比例：若某样本过滤后保留率显著低于同批，说明原始数据质量差或接头污染严重。
rRNA比例：RNA-seq中若rRNA占比超过10%～20%，会显著压缩有效表达信息，需考虑rRNA去除策略或样本降解问题。

四、实战：一批临床测序数据的质量评估与过滤

假设我们收到一批临床样本，包含3例WGS、3例WES和3例RNA-seq，原始FASTQ存放于raw_fastq/目录。第一步，对全部样本运行FastQC：

fastqc raw_fastq/*.fastq.gz -o qc_raw/ -t 4

随后使用MultiQC汇总：

multiqc qc_raw/ -o qc_raw/multiqc_report.html

假设汇总报告显示：WGS样本Q30均在88%以上，重复率12%～18%，接头含量低；WES样本Q30在86%～90%，但其中1例样本目标区覆盖均一性较差，重复率偏高至28%；RNA-seq样本中1例rRNA比例达到24%，且3′/5′偏好性明显。此时应分别处理：WGS样本可直接进入比对；WES高重复样本需检查捕获批次和文库复杂度，必要时重新建库；RNA-seq高rRNA样本应使用rRNA去除或调整分析策略，并在报告中标注数据质量限制。

过滤环节可使用fastp完成接头去除、质量修剪和长度筛选：

fastp -i raw_fastq/sample1_R1.fastq.gz -I raw_fastq/sample1_R2.fastq.gz \
  -o clean_fastq/sample1_R1.clean.fastq.gz -O clean_fastq/sample1_R2.clean.fastq.gz \
  --detect_adapter_for_pe --qualified_quality_phred 20 \
  --length_required 50 --cut_tail --cut_tail_mean_quality 20 \
  --json qc_clean/sample1.fastp.json --html qc_clean/sample1.fastp.html

过滤后再次运行FastQC和MultiQC，对比过滤前后Q30、接头比例和重复率变化。若过滤后Q30提升至90%以上、接头比例降至1%以下，说明过滤有效；若重复率仍居高不下，则需回到建库或样本质量层面排查，而不是继续增加过滤强度。

临床质控的核心不是追求“全部指标完美”，而是识别哪些异常会影响目标应用。WGS关注覆盖均一性和SV检测能力，WES关注目标区捕获效率，RNA-seq关注rRNA残留和表达信息完整性。质控结论应写入分析报告，作为后续结果解读的置信度依据。

注意：FastQC的“失败”不等于样本不可用，MultiQC的汇总也不替代单样本细节。对于临床样本，任何过滤参数调整都应记录在分析日志中，确保结果可追溯。若样本质量确实不满足目标应用，应明确标注“数据质量限制”，避免下游假阴性或假阳性结论。

综上，高通量测序数据的生成与质控是一个“策略选择—质量画像—横向比较—过滤验证”的闭环。理解WGS、WES、RNA-seq的生成差异，掌握FastQC与MultiQC的判读逻辑，并结合临床目标设定合理的过滤阈值，才能为后续多组学整合提供可靠的数据基础。