3. 临床样本采集与前处理工程
多组学研究的成败，往往在样本进入测序仪或质谱仪之前就已经决定。血液、组织、尿液三类样本承载的分子信息不同，对采集、运输、存储和前处理的要求也各不相同。本节围绕“如何设计一个可执行、可追溯、可复现的多组学样本队列采集与前处理方案”展开，重点讲清操作对象、关键参数、时间窗口和质控判断依据。
一、三类样本的分子定位与采集差异
血液是循环系统的“实时快照”，适合做基因组（gDNA）、cfDNA、血浆蛋白组和代谢组。采集时需区分EDTA抗凝管（基因组、cfDNA）、柠檬酸钠管（凝血相关蛋白）和促凝管（血清）。组织样本是空间与细胞异质性的来源，需在离体后尽快处理，用于DNA、RNA、蛋白和空间组学。尿液是非侵入性样本，适合代谢组、蛋白组和尿液cfDNA，但受饮水、pH和菌群影响大，需记录采集时段与体积。
三类样本的共同敌人是时间与温度。离体后缺血时间、室温放置时间、冻融次数都会改变分子丰度。因此方案设计的第一原则是：先固定时间窗口，再选择保存方式。
二、采集与前处理SOP的关键参数
以血液cfDNA为例，采血管选择K2EDTA管，采集后轻柔颠倒8–10次混匀，禁止剧烈震荡以免溶血。室温放置不超过2小时，若无法及时离心，应在4℃暂存但不超过4小时。离心分两步：第一步1600 g、4℃、10分钟，吸取血浆层；第二步16000 g、4℃、10分钟去除残余细胞碎片。血浆分装为1 mL/管，-80℃保存。cfDNA提取时需使用片段大小选择磁珠，目标片段约170 bp，避免基因组DNA污染。
组织样本的关键是“冷缺血时间”和“切分顺序”。离体后30分钟内完成切分，优先切取用于RNA的部分，立即放入液氮或RNAlater。用于空间组学的组织块应保持形态完整，避免挤压，可包埋于OCT后-80℃保存。切分时记录块径（如3 mm×3 mm×3 mm），因为块径影响匀浆效率和提取产量。
尿液样本需记录采集时段（晨尿/随机尿）、体积和pH。代谢组学建议加入叠氮钠至0.02%抑制细菌生长，蛋白组学则需离心去除细胞和碎片。尿液样本不宜反复冻融，建议分装为0.5 mL/管。
三、队列方案设计示例
假设某肺癌多组学队列计划入组200例，每例采集血液、肿瘤组织和配对癌旁组织、尿液。方案设计如下：
| 样本类型 | 采集容器 | 运输条件 | 前处理时限 | 存储温度 | 目标组学 |
|---|---|---|---|---|---|
| 全血 | K2EDTA管 | 4℃冰盒 | 2 h内离心 | -80℃ | gDNA、cfDNA |
| 血清 | 促凝管 | 室温≤1 h | 1 h内离心 | -80℃ | 蛋白组、代谢组 |
| 肿瘤组织 | 冻存管/RNAlater | 液氮 | 30 min内切分 | -150℃ | RNA、蛋白、空间 |
| 癌旁组织 | 冻存管 | 液氮 | 30 min内切分 | -150℃ | DNA、RNA |
| 尿液 | 无菌尿杯 | 4℃ | 2 h内离心 | -80℃ | 代谢组、cfDNA |
每例样本分配唯一队列ID，格式为LC-2024-001，子样本ID追加类型后缀，如LC-2024-001-BL（血液）、LC-2024-001-TU（肿瘤）、LC-2024-001-UR（尿液）。所有样本在采集、运输、分装、入库环节均需扫码记录时间戳和操作人。
四、质控与异常处理
质控不是最后一步，而是贯穿全程。采集环节检查溶血、凝块和标签错误；运输环节检查温度记录仪是否超标；前处理环节检查离心后分层是否清晰；入库后检查DNA/RNA完整性和蛋白浓度。若RNA的RIN值低于7，应标记为“仅用于DNA或蛋白组学”，不进入转录组分析。若cfDNA提取量低于5 ng，需评估是否重新采集或改用低输入建库方案。
常见异常与处理：溶血样本会导致血红蛋白污染，影响蛋白组和代谢组，应记录并优先用于gDNA提取；组织RNA降解时，可尝试从同一块组织的DNA或蛋白部分补救；尿液pH过高（>8）会加速代谢物降解，需在方案中限定采集时段并记录。
五、可执行成果：样本采集与前处理记录表
以下为可直接用于队列执行的记录表字段示例，每个样本一行，随样本流转：
队列ID：LC-2024-001
样本类型：血液 / 组织 / 尿液
采集时间：2024-06-01 08:15
采集人：张三
抗凝剂/容器：K2EDTA / 促凝管 / 无菌尿杯
运输温度：4℃ / 室温 / 液氮
运输时长：45 min
前处理开始时间：2024-06-01 09:00
离心参数：1600 g, 4℃, 10 min
分装管数：4
存储温度：-80℃
存储位置：FZ-A-03-12
质控结果：DNA A260/280=1.86；RNA RIN=8.2；蛋白浓度=2.4 μg/μL
异常记录：无
操作人：李四
复核人：王五
该记录表与条码系统绑定后，可实现从采集到组学数据的全链路追溯。方案设计时还需预留10%–15%的样本冗余，用于质控失败后的重采或复测。最终，一个可复现的多组学队列，依赖的不是单点技术，而是每个环节的时间、温度和标识都被明确约束并记录。