2. 实验设计与样本准备
做RNA-seq实验，说白了就是在回答一个问题：你拿到的差异基因，到底是真的差异，还是随机波动？我见过太多新手，花了大价钱跑测序，结果因为实验设计没想清楚，最后连个靠谱的p值都算不出来。
今天咱们就把这事掰扯清楚。我个人习惯在定下实验方案之前，先画一张简单的决策图。你看下面这张，基本覆盖了三大核心要素的决策顺序。
生物学重复：命根子
我刚开始做生信时，接到过一个项目，每组只给了2个样本。结果跑差异分析，一堆基因p值显著但log2FC只有0.3。你想想看，2个样本的方差估计基本靠运气，出来的结果根本不敢信。
生物学重复指的是从不同个体或独立培养物中取样，反映的是群体水平的随机变异。与之相对的是技术重复——同一管样本分几份重复建库。技术重复能衡量操作误差，但对差异分析没太多帮助。
实际项目中，我建议按这个表来定重复数：
| 应用场景 | 每组最少重复数 | 备注 |
|---|---|---|
| 探索性研究/预实验 | 3 | 先跑3个，效果不好再加 |
| 常规差异表达分析（细胞系） | 3～4 | 细胞系变异小，3个基本够 |
| 临床组织样本、动物实验 | 5～8 | 个体差异大，宁多勿少 |
| 高度异质性（肿瘤、环境样本） | 8～12 | 统计效能是关键 |
| 时间序列或剂量梯度 | 3～5/时间/浓度 | 倍数关系分析需要更密 |
核心原则：重复数越高，差异检测的统计效能越强。但也要考虑预算，我一般推荐“安全线”——每组至少3个生物学重复，临床样本至少4个。
你可能想问：“那能不能用技术重复代替生物学重复？”千万别。技术重复只能减少建库/测序噪声，却无法代表群体的真实变异。我见过有人为了省钱，3个样本各做2次技术重复，总共6个数据点，但本质上还是n=3，假阳性高得离谱。
避坑指南：我曾经接手一个公共数据集，每组只有2个重复，做差异分析时DESeq2直接报“基因数太少，无法估计色散”。最后只能用fold change简单排名，完全没法做统计检验。所以，重复数是做差异分析的底线。
测序深度：够用就好
测序深度，说白了就是每个样本你跑了多少条reads。单位通常用百万reads（M）表示。比如“10M”代表1千万条双端reads。
深度不够，低表达基因就检测不到；深度太高，边际效益递减，钱白花。我习惯把它跟分析目标绑定：
- 基因表达定量（常规差异分析）：10～20M reads/样本（SE）或 20～40M PE reads。够了。
- 寻找低表达基因、可变剪接或新转录本：需要 60～100M PE reads。比如你要找融合基因或者稀有异构体。
- 小RNA或miRNA测序：一般5～10M就够了，因为小RNA种类有限。
- 单细胞RNA-seq：深度通常比bulk低得多，但那是另一套参数，不在本章讨论。
这里有个常见误区：很多人觉得“多跑点reads肯定更好”。确实，更深的测序能检测到更多基因，但差异分析用到的基因通常是中高表达的。额外的reads大多浪费在已经饱和的转录本上。我做过一个实验，同样的样本分别跑了20M、40M、80M reads，最终筛选出的差异基因数量几乎一样。
我的经验：如果预算有限，优先加重复数，而不是堆深度。多一组重复带来的统计增益，远大于把同一样本从30M升到60M。不信你用power分析算算。
文库类型：选错了，结果全废
文库类型的选择会直接影响你后续能做什么分析。咱们重点说三个维度。
1. 单端（SE） vs 双端（PE）
| 特性 | SE | PE |
|---|---|---|
| 测序成本 | 低（约一半） | 高 |
| 比对准确率 | 中等 | 高（尤其对重复区域） |
| 可变剪接分析 | 基本不可用 | 可以（利用插入片段） |
| 融合基因检测 | 困难 | 容易 |
| 推荐场景 | 单纯表达定量 | 几乎所有差异分析项目 |
我个人习惯：凡是大批量RNA-seq项目，只要预算允许，一律双端100bp或150bp。单端虽然省钱，但后期分析灵活性差太多。比如你想看剪接事件，双端数据是必须的。
2. 链特异性文库（stranded） vs 非链特异性（unstranded）
链特异性文库能保留转录本的方向信息，也就是你知道reads来自正义链还是反义链。这对差异分析有什么影响？
- 非链特异性文库：无法区分互补链上的reads，会导致基因定量的低估和反义转录本的混杂。
- 链特异性文库：可以准确计算每个基因表达量，还能做反义转录本分析。
现在主流期刊基本要求链特异性数据。我手头有一个案例：用非链特异性数据分析同一个样本，结果显示某些基因的表达量只有链特异性结果的60%，因为部分reads被错误分配到了互补链上。
避坑指南：我曾经帮一个课题组复现论文结果，对方用的是非链特异性文库。结果跑差异分析后，发现有不少所谓的“差异基因”其实是反义链污染造成的假阳性。后来换了链特异性数据，差异基因减少了三分之一。所以，如果你是做差异表达分析，优先选链特异性文库。
3. PolyA 富集 vs rRNA 去除 vs 总RNA
| 方法 | 适用场景 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| PolyA 富集 | 真核生物mRNA（多聚腺苷尾） | 有效去除rRNA，得到高质量mRNA | 丢失非polyA RNA（如lncRNA、histone RNA） |
| rRNA 去除 | 总RNA（含lncRNA、circRNA） | 保留大部分RNA种类；可用于原核生物 | rRNA残留较多，成本稍高 |
| 总RNA（不处理） | 仅用于特殊协议（如single-cell） | 信息完整 | 绝大部分数据是rRNA，浪费深度 |
我通常这样选：如果只关注mRNA差异表达，选PolyA富集最经济；如果还想看lncRNA、环状RNA，或者研究原核生物，必须用rRNA去除。有些预算充足的大项目会两种都做，但那是另一回事。
总结一下：实验设计前，先问自己三个问题——
- 我的重复数够不够做统计检验？
- 我的测序深度能不能覆盖目标基因？
- 我的文库类型能不能支持后续分析？
这三个问题没想清楚，后面所有分析都是沙上建塔。
实际项目中的检查清单
为了让你少走弯路，我把我在项目中最常检查的点列成清单。每次送样前对着过一遍：
- 每组生物学重复是否≥3？如果组织样本，是否≥5？
- 样本来源是否一致？比如动物品系、给药方式、细胞代次。
- 是否设计了交叉批次？尽量避免同一组样本在一个batch，另一组在另一个batch。
- 测序深度是否匹配分析目标？要做剪接就≥40M PE。
- 文库是否用了链特异性？如果是新项目，默认选链特异性。
- 建库方案是否与参考基因组类型匹配？比如人、小鼠用PolyA没问题；但植物、微生物用rRNA去除。
- 有没有预留足够的样本量用于潜在的验证实验？（比如qPCR）
这些都在样本准备阶段定好，后续的数据分析会顺利得多。很多后期头疼的问题，根源都在实验设计这一步。