3. 种曲制备与米曲霉培养
酱油酿造的本质，是米曲霉把大豆和小麦中的蛋白质、淀粉分解成氨基酸和糖类，再由后续发酵赋予色香味。种曲就是这一过程的“火种”——它是由米曲霉纯种在蒸煮过的麸皮等基质上扩大培养得到的、富含孢子的曲种。种曲质量不过关，后面制曲再精细也难以补救。本节围绕米曲霉的生物学特性、种曲制作流程、孢子计数与活力评价、污染防控，以及种曲质量对发酵的影响展开。
一、米曲霉的生物学特性
酱油生产常用菌种为米曲霉（Aspergillus oryzae），属于半知菌亚门丝孢目。它的菌丝有隔膜、多核，分枝旺盛；无性繁殖产生分生孢子，孢子梗顶端膨大成顶囊，顶囊表面生出瓶梗，瓶梗上串生球形孢子，成熟后呈黄绿色至黄褐色。米曲霉是典型的好氧真菌，生长需要氧气、适宜水分和温度，最适生长温度约30～32℃，产酶最适温度略低，约28～30℃；孢子萌发需要较高湿度，基质含水量一般控制在50%～55%。
米曲霉的酶系非常丰富，主要包括蛋白酶（酸性、中性、碱性）、淀粉酶（α-淀粉酶、糖化酶）、谷氨酰胺酶等。其中中性蛋白酶和碱性蛋白酶负责把大豆蛋白降解为肽和氨基酸，谷氨酰胺酶则把谷氨酰胺转化为谷氨酸，直接关系酱油的鲜味。米曲霉还能产生少量脂肪酶和纤维素酶，辅助分解原料中的脂类和纤维。理解这些特性，就能明白种曲培养为什么强调“控温、保湿、通风、防污染”——温度过高会抑制产酶甚至烧曲，湿度过低孢子萌发困难，通风不足则菌丝生长稀疏。
二、种曲制作流程
种曲制作是从试管斜面出发的逐级扩大培养，典型流程为：斜面菌种→三角瓶扩大→种曲（麸皮曲）。以三角瓶扩大为例，取麸皮与豆粕按约8:2混合，加水至含水量约55%，装入500 mL三角瓶，每瓶装料约30～40 g，121℃灭菌30 min，冷却后接入斜面孢子悬液，30℃恒温培养。培养约24 h后菌丝开始旺盛生长，此时需摇瓶打散结块，保证通气均匀；48～72 h后孢子大量形成，瓶壁可见黄绿色孢子层，即可作为种曲使用或进一步扩大。
种曲阶段通常在曲盘或通风曲池中进行，料层厚度控制在2～3 cm，接种量约为干料的0.3%～0.5%，培养温度维持30～32℃，品温不得超过35℃。培养前期（0～20 h）以保湿为主，中期（20～40 h）菌丝旺盛、产热明显，需翻曲散热并补充氧气，后期（40～72 h）孢子成熟，应适当降低湿度、加强通风，促进孢子干燥和成熟。整个周期约60～72 h，成熟种曲孢子数应达到10⁹～10¹⁰个/g（干基），水分降至10%～12%以便短期保存。
三、孢子计数与活力评价
种曲质量的第一项硬指标是孢子数量。常用方法是血球计数板法：称取种曲1 g，加入含0.1%吐温-80的无菌水100 mL，充分振荡使孢子分散，用纱布过滤去除菌丝，取滤液滴入血球计数板，静置2～3 min后在400倍显微镜下计数中央大方格内孢子数，按公式计算：孢子数（个/g）=（5个中方格孢子总数/5）×25×10⁴×稀释倍数。若5个中方格共数得120个孢子、稀释倍数为100，则孢子数约为120/5×25×10⁴×100=6.0×10⁸个/g。计数时每个样品至少重复3次取平均，偏差过大应重新制样。
孢子数量达标不等于活力好。活力评价更看重萌发能力：可取孢子悬液涂布于PDA平板，30℃培养12～16 h，镜检统计萌发孢子比例，萌发率应达到85%以上；也可用美蓝染色法，活孢子不着色、死孢子染成蓝色，据此估算活孢子率。此外，还可通过测定种曲的中性蛋白酶活力间接反映产酶潜力——活力高说明菌株代谢旺盛。生产上常把“孢子数≥10⁹个/g、萌发率≥85%、杂菌率低、无霉味”作为种曲合格的综合判据。
四、种曲污染防控
种曲培养周期长、营养丰富，是杂菌（细菌、青霉、毛霉等）的温床。防控要从源头到环境全链条入手：菌种本身须经纯化验证，斜面定期转接、避免退化；培养基灭菌必须彻底，121℃、30 min，灭菌后冷却至30℃左右再接种，防止冷凝水过多；接种操作在超净工作台或无菌室内完成，器具、双手、瓶口均需酒精消毒并火焰灼烧；培养室提前用甲醛或过氧乙酸熏蒸，曲盘、曲池清洗消毒；培养期间保持正压和过滤空气，翻曲工具专用并消毒。一旦发现曲料出现异味、黑斑、黏丝或非黄绿色的菌落，应立即隔离废弃，不可混用。
五、种曲质量对发酵的影响案例
某酱油厂曾出现一批大曲“发酵无力”的问题：制曲48 h后曲料升温缓慢、酶活偏低，酱醪发酵周期延长、氨基酸态氮不达标。排查发现，问题出在种曲环节——该批种曲因培养后期通风不足、品温一度升至38℃，孢子虽已形成但活力明显下降，镜检萌发率仅约60%，且混有少量青霉。更换活力合格的种曲后，大曲中性蛋白酶活力恢复，酱醪氨基酸态氮在正常周期内达到0.8 g/100 mL以上。这个案例说明：种曲的孢子数量、活力和纯度，会沿着“种曲→大曲→酱醪”逐级放大，种曲环节的微小偏差，最终会体现在成品酱油的鲜味和出油率上。因此，把种曲质量检测作为每批生产的固定关卡，比事后补救更经济可靠。