4. 实验设计中的统计与机器学习基础
在AI辅助生物实验设计中，统计与机器学习方法并不是“拿到数据后再套用”的工具，而是从实验设计阶段就参与决策的推理框架。它们各自回答不同的问题，也各自有明确的适用边界。理解这些边界，比记住算法名称更重要。
假设检验：判断“差异是否真实存在”
假设检验用于回答：观察到的组间差异，是否可能仅由随机波动造成。在实验设计中，它直接决定样本量、对照设置和重复次数。以两组基因表达量比较为例，零假设 H₀ 为“两组均值无差异”，备择假设 H₁ 为“存在差异”。若使用双样本 t 检验，需先明确显著性水平 α（常用 0.05）、预期效应量 Cohen's d 和检验效能 1−β（常用 0.8），再反推每组所需样本量。
例如，假设某 CRISPR 敲除实验预期使目标蛋白表达下降 30%，历史数据标准差约为表达量的 15%，则效应量 d≈2.0。在 α=0.05、power=0.8 下，每组约需 6 个生物学重复。若把 α 收紧到 0.01，样本量会明显上升。这说明假设检验的核心作用不是“算 p 值”，而是在实验开始前约束资源投入与结论可靠性之间的平衡。
回归：刻画连续变量之间的定量关系
回归用于建模一个或多个自变量与连续因变量之间的关系。在生物实验中，它常用于剂量—效应曲线、标准曲线、代谢物浓度预测等。线性回归形式为 y=β₀+β₁x+ε，其中 β₁ 表示 x 每变化一个单位时 y 的平均变化量。若关系非线性，可用多项式回归或广义加性模型。
回归在实验设计中的角色是：帮助确定需要采集哪些自变量、是否需要交互项、以及采样点应如何分布。例如研究温度对酶活性的影响，若预期存在最适温度，则应在最适点附近加密采样，而不是均匀布点。回归的边界在于：它描述相关与预测关系，不自动证明因果；外推到训练数据范围之外风险很高。
分类：预测离散类别与筛选候选
分类用于预测样本属于哪一类，如“耐药/敏感”“致病/非致病”。在实验设计中，分类模型可用于优先挑选值得进一步验证的候选，例如从数百个突变中筛出最可能影响表型的 20 个。常用方法包括逻辑回归、随机森林和支持向量机。
分类的关键设计参数是：类别定义是否互斥、正负样本比例、以及评价指标。若正样本极少，准确率会失真，应关注召回率、精确率和 AUC。分类的边界是：模型输出的是概率或类别，不是机制解释；高 AUC 不等于找到了因果靶点。
聚类：发现样本或基因的自然分组
聚类属于无监督学习，用于在没有标签的情况下发现数据结构。在实验中，它常用于单细胞测序的细胞分群、基因表达模块识别、样本质量控制。常用方法有 K-means、层次聚类和 DBSCAN。
聚类在实验设计中的价值是：帮助判断是否需要分层、是否存在批次效应、以及分组是否合理。例如对 96 个样本做层次聚类，若发现聚类结果与测序批次高度重合，说明批次效应显著，应在建模前校正。聚类的边界是：聚类结果依赖距离度量和参数，簇数往往需要结合生物学意义判断，不能仅凭算法输出下结论。
降维：在保留结构的前提下压缩维度
降维用于把高维数据映射到低维空间，便于可视化和去噪。主成分分析（PCA）是最常用的线性方法，它把原始变量转换为互不相关的主成分，第一主成分方向为数据方差最大的方向。t-SNE 和 UMAP 更适合非线性结构的可视化。
在实验设计中，降维可用于检查样本整体分布、发现离群样本、评估处理组是否分离。例如对 2000 个基因、30 个样本的表达矩阵做 PCA，若前两个主成分解释 65% 方差，且处理组与对照组沿 PC1 分离，说明处理效应是主要变异来源。降维的边界是：主成分本身通常没有直接生物学含义，不能把 PC1 当作某个具体基因或通路。
如何在实验设计中协同使用这些方法
一个典型的 AI 辅助实验设计流程可以这样组织：首先用假设检验确定样本量和主要终点；若终点是连续变量，用回归或分类建模；若需探索样本结构，用聚类和降维做质量控制与分层；最后用独立验证集评估模型是否可用于筛选候选。关键在于：方法选择由问题类型决定，而不是由算法流行度决定。
例如，设计一个药物响应实验：主要终点是 IC50 变化，属于连续变量，适合回归；同时希望从 50 个候选标志物中筛出 5 个用于后续验证，适合分类；在建模前用 PCA 检查样本是否按批次聚集，用层次聚类确认是否存在亚群。若发现批次效应，应在设计阶段增加随机化或区组，而不是事后强行校正。
常见误区与设计层面的规避
第一，把假设检验当成“事后找显著”。正确做法是在设计阶段固定主要终点和检验方法。第二，用分类模型的高准确率代替因果验证。分类只说明可预测性，不说明干预有效性。第三，聚类后直接命名细胞类型而不做标记基因验证。第四，降维图上组间分离就断言处理有效，却忽略重复数和统计检验。
这些误区的共同根源，是把统计与机器学习方法从实验设计流程中剥离出来，当成独立的数据分析步骤。实际上，它们应嵌入设计阶段：样本量由检验效能决定，采样点由回归模型预期决定，候选筛选标准由分类评价指标决定，分层策略由聚类和降维结果决定。只有把方法边界写进设计文档，AI 辅助实验设计才真正具备可复现性和可解释性。