2. 多组学数据获取与实验设计

多组学整合分析的质量上限，往往在样本进入测序仪或质谱仪之前就已经被决定了。同一份生物样本，如果基因组、转录组、蛋白质组、代谢组分别来自不同批次、不同保存条件、不同个体，后续无论用多么复杂的算法，都很难把真实的生物学差异从技术噪声中分离出来。因此，本节从平台原理出发，讨论样本配对策略、批次效应预防与实验设计原则，目标是让读者能够判断“这批数据能不能整合”“该怎么设计才能整合”。

一、四类常见平台的测量对象与数据特性

基因组平台（以 Illumina 短读长测序为主）测量的是 DNA 层面的变异，包括 SNP、InDel、结构变异和拷贝数变化。它的特点是序列稳定、受时间影响小，同一份 DNA 反复测序结果高度一致，因此基因组数据通常作为“不随状态变化”的基线层。转录组平台（RNA-seq）测量的是 RNA 丰度，反映基因表达状态，对样本采集后的降解、冻融次数、建库批次非常敏感。蛋白质组（以 LC-MS/MS 为主）测量肽段和蛋白丰度，受蛋白提取效率、酶切效率、色谱柱状态影响显著。代谢组（LC-MS 或 GC-MS）测量小分子，样本量小、代谢转换快，采集后几分钟内代谢物就可能发生变化。

这四类平台的差异决定了它们的“脆弱点”不同：基因组怕样本混淆，转录组怕降解和批次，蛋白质组怕前处理差异，代谢组怕采集与淬灭延迟。实验设计必须针对这些脆弱点分别设防。

二、样本配对策略：从“同源”到“同管”

多组学整合的前提是各层数据能够对应到同一个生物学个体或同一个样本。配对策略按严格程度可分为三级。第一级是“同源配对”：基因组、转录组、蛋白质组、代谢组来自同一供体的同一时间点，但可能分装在不同管中。第二级是“同管配对”：从同一管裂解液中分取 DNA、RNA、蛋白和代谢物，最大程度保证样本一致性。第三级是“同片配对”：对同一组织切片相邻区域分别做不同组学，适用于空间组学场景。

实际操作中，最常用的是同源配对加统一分装。例如一项肿瘤多组学研究，采集新鲜组织后立即切成三份：一份液氮速冻用于 RNA-seq，一份福尔马林固定用于基因组，一份用于蛋白质和代谢组。三份样本必须记录同一供体编号、同一采集时间、同一冻存时长。如果做不到同管，至少要做到“同一采集窗口、同一保存液、同一冻融次数”。

对于血液样本，推荐使用 EDTA 抗凝管采集后 30 分钟内完成血浆分离，血浆用于代谢组，血细胞用于基因组和转录组。若采集后放置超过 2 小时，代谢物谱会发生明显改变，此时代谢组数据与基因组数据的配对就失去了生物学意义。

三、批次效应的来源与预防

批次效应是指由于实验时间、操作人员、试剂批号、仪器状态等非生物学因素导致的系统性偏差。它最危险的地方在于：如果批次与生物学条件完全重合（例如所有对照组都在第一批测，所有处理组都在第二批测），那么批次效应和真实生物学效应将无法区分，任何统计方法都无法挽救。

预防批次效应的核心手段是随机化和区组化。随机化是指将不同条件的样本随机分配到不同批次中，使批次与条件不相关。区组化是指将同一批次的样本作为一个区组，在分析时把区组作为协变量纳入模型。具体做法包括：

• 建库随机化：不要按条件顺序建库，而是把所有样本编号后随机打乱，每批建库都包含对照组和处理组。
• 质控锚点：每批插入一个参考样本（如混合样本或标准品），用于后续批次校正。参考样本在不同批次中的信号差异，就是批次效应的直接估计。
• 元数据记录：记录每批的建库日期、操作人、试剂批号、仪器编号、测序 lane 号。这些信息是后续 ComBat、limma 等校正方法的输入。
• 避免“全条件同批”：如果条件数多于批次容量，宁可增加批次、每批包含所有条件，也不要让某个条件独占一个批次。

四、实验设计原则与最小可行方案

多组学实验设计需要同时满足三个约束：生物学重复足够、批次可平衡、样本量可承受。对于探索性研究，每组至少 3 个生物学重复；对于验证性研究，每组建议 5～10 个。如果要做多组学整合，建议优先保证“配对样本数”而不是“每组样本数”，因为配对设计可以消除个体间差异，显著提高统计效力。

一个最小可行的四组学设计示例：选择 6 只同品系小鼠，随机分为对照组和实验组各 3 只。每只小鼠采集肝脏组织，同一管裂解后分取 DNA、RNA、蛋白和代谢物。建库时，将 6 只小鼠的样本随机打乱，分两批建库，每批包含对照组和处理组各 1～2 只，每批插入 1 个混合参考样本。测序时，每批样本尽量分布在不同的 lane 上，避免 lane 效应与批次效应叠加。分析时，将批次作为协变量，先做批次校正，再做差异分析和整合。

对于临床样本，如果无法做到同管配对，至少要做到“同一患者、同一时间点、同一保存条件”。如果样本来自不同医院或不同年份，必须在设计阶段记录来源批次，并在分析时将其作为固定效应或随机效应纳入模型。若批次与分组无法解耦，应在结论中明确说明该限制，避免过度解读。

五、从设计到分析的检查清单

最后需要强调：多组学整合不是“先测了再说”，而是“先设计再测”。平台原理决定了样本的脆弱点，配对策略决定了数据能否对应，批次预防决定了信号能否被识别。把这三件事在实验开始前想清楚，后续的整合分析才有意义。