2. 样本采集与实验设计

蛋白质组学结果的可靠性，在质谱开机之前就已经被样本采集与实验设计决定了大半。前处理工程的第一原则是：先定义生物学问题，再决定样本类型、重复结构与批次安排。如果样本类型与问题不匹配，后续再精细的裂解、酶切和分级也难以补救。

一、样本类型选择：先问“要回答什么生物学问题”

常见样本类型包括培养细胞、组织、血浆/血清、尿液、脑脊液、唾液及各类灌洗液。选择时至少同时考虑三个维度：目标蛋白丰度与动态范围、样本可获得量与伦理可行性、前处理可重复性。

• 培养细胞：均一性好、蛋白量可控，适合机制研究。但需注意传代次数、汇合度与血清饥饿状态，这些因素会显著改变蛋白丰度谱。
• 实体组织：需明确取材部位、缺血时间与保存方式。同一器官不同区域蛋白谱差异可能大于组间差异，取材位置必须统一并记录。
• 血浆/血清：动态范围可达10¹⁰以上，12种高丰度蛋白占总量约95%，低丰度标志物常被掩盖。若不做去高丰度或富集，通常只能获得高丰度蛋白信息。
• 尿液：无创、可重复采集，但蛋白浓度波动大，需记录采集时段、是否加防腐剂及浓缩方式。

一个实用的判断顺序是：先确认目标蛋白是否已知、是否低丰度；再评估样本量能否支撑去高丰度或富集步骤；最后确认采集方式能否在全部样本间保持一致。若样本量仅够一次酶切，就不应设计需要去除高丰度蛋白的流程。

二、生物学重复与技术重复：重复的是“谁”

生物学重复指来自不同个体、不同批次细胞或不同动物的独立样本，用于估计生物学变异并支撑组间统计推断。技术重复指同一样本被多次取样、多次酶切或多次上机，用于估计前处理与仪器的技术变异。二者不可互相替代。

设计时建议先做小规模预实验估计变异：若技术变异（CV）远小于生物学变异，则统计功效主要由生物学重复数决定，应优先增加生物学重复；若技术CV接近或超过生物学CV，应先优化前处理与仪器稳定性，而不是盲目增加样本数。示例性经验值是：细胞样本每组至少3个生物学重复，动物或临床样本每组通常需要6～10个以上，具体取决于效应大小与个体差异。技术重复一般每组1～2次即可，主要用于质控而非统计推断。

三、随机化与批次设计：让批次效应不偏向任何一组

样本前处理与质谱上机不可避免存在批次效应，例如不同天的酶切效率、不同批次的色谱柱状态、不同操作者。控制批次效应的核心是随机化与区组化：

• 随机化：样本处理顺序、上机顺序应随机分配，避免“先处理对照组、后处理处理组”这类系统性偏差。
• 区组化：若一天只能处理8个样本，应让每个区组内包含各组样本，而不是按组别分天处理。
• 平衡设计：各组样本在批次间尽量均匀分布，使批次效应与生物学分组不共线，后续可用ComBat、limma等校正。

下面这张图给出一个典型的“样本—批次—重复”关系示意：同一研究中的样本被分配到不同处理批次与上机批次，每个批次内各组均有分布，技术重复仅用于质控。

四、临床样本采集规范

临床样本的难点在于采集时间点、禁食状态、抗凝剂、离心与冻存都会改变蛋白谱。建议固定以下要素并写入记录表：

• 采集时间：统一为清晨空腹，避免昼夜节律与进食影响。
• 抗凝剂：血浆常用EDTA或枸橼酸盐，不同抗凝剂会影响部分蛋白与肽段检出，全研究必须统一。
• 离心条件：采血后尽快离心（如4℃、1500×g、10分钟），分离血浆/血清，避免溶血；溶血会释放大量血红蛋白，严重干扰低丰度蛋白检测。
• 分装与冻存：小体积分装，避免反复冻融；-80℃保存，记录冻融次数。
• 伦理与知情同意：样本采集前完成伦理审批与知情同意，样本编号与临床信息分离管理。

五、动物样本采集规范

动物实验需控制品系、年龄、性别、饲养环境、麻醉方式、取材时间与灌注方式。以小鼠肝脏为例，常用流程是：麻醉后快速开腹，经门静脉灌注PBS去除血液，取出肝脏后立即在液氮中速冻或置于裂解液中匀浆。关键控制点包括：

• 取材时间尽量短，避免缺血导致蛋白降解；
• 同一实验所有动物由同一操作者、同一时间段完成取材；
• 组织块大小一致，保证裂解效率与蛋白提取量可比；
• 记录禁食时间、麻醉剂种类与剂量，这些因素会影响代谢相关蛋白丰度。

六、可直接使用的设计检查清单（示例）

把上述要素在实验开始前固定下来，后续的裂解、还原烷基化、酶切与上机才有可比性。样本采集与实验设计不是前处理的“准备阶段”，而是决定蛋白质组数据能否支撑统计推断的第一道工程关口。