2. 样本采集前的实验设计

多组学实验的成本高、周期长，一旦样本采集完成再发现设计缺陷，往往无法补救。因此，采集前的实验设计决定了后续数据能否支撑统计推断。本节围绕四个相互关联的决策展开：需要多少样本、重复如何设置、批次效应如何预防、样本如何分组与随机化。

一、样本量估算：先明确要检测的效应量

样本量估算的起点不是"越多越好"，而是"要检测多大的差异"。以转录组差异表达为例，若预期某基因在处理组与对照组间有 2 倍变化（log2FC = 1），而组内生物学变异的标准差约为 0.5（log2 尺度），则标准化效应量 d ≈ 1/0.5 = 2，属于较大效应；若组内标准差为 1.0，则 d = 1，属中等效应。效应量越小，所需样本量越大。

在两组比较、双侧检验、显著性水平 α = 0.05、把握度 1−β = 0.8 的常规设定下，可用近似公式估算每组样本量：

n ≈ 2 × (Z(1−α/2) + Z(1−β))² / d²
  = 2 × (1.96 + 0.84)² / d²
  = 15.68 / d²

d = 2  → n ≈ 4（每组）
d = 1  → n ≈ 16（每组）
d = 0.5 → n ≈ 63（每组）

这说明：检测大效应时每组 3～4 个生物学重复可能足够，而检测小效应时样本量需求急剧上升。多组学中还需考虑多重检验校正，若使用 FDR 控制，实际所需样本量通常比上述粗略估算更高。对于代谢组、蛋白组等变异来源更多的组学，建议先做预实验估计组内变异系数（CV），再代入估算。需要强调：上述数值为示例性估算，实际设计应结合预实验数据、目标组学平台和统计方法确定。

二、生物学重复与技术重复：分清两种重复的作用

生物学重复（biological replicate）指来自不同个体、不同植株或不同独立培养批次的样本，反映的是群体层面的真实变异，是统计推断的基础。技术重复（technical replicate）指同一份生物学样本在检测环节被重复测量，反映的是仪器、操作和流程的随机误差。

两者的用途不同：生物学重复用于估计组间差异是否可推广到群体；技术重复用于评估检测平台的稳定性，不能替代生物学重复。常见误区是"用 3 次技术重复代替 3 个生物学重复"，这会导致统计自由度虚高、假阳性增加。一般建议：生物学重复每组不少于 3 个，条件允许时 6～10 个更稳健；技术重复在预实验或平台验证阶段设置 2～3 次即可，正式实验可减少或不设，把资源优先投入生物学重复。

三、批次效应预防：从设计阶段切断混杂

批次效应指由实验时间、操作人员、试剂批号、仪器状态等非生物学因素引起的系统性偏差。它最危险的形式是与分组混杂——例如"对照组全部在第 1 天处理，处理组全部在第 2 天处理"，此时批次效应与处理效应完全无法区分，任何统计方法都无法挽救。

预防的核心原则是：让批次与分组正交。具体做法包括：将不同组别的样本分散到每个批次中，使每个批次都包含所有组别的样本；若无法做到完全平衡，至少保证每组在多个批次中都有分布。此外，采集时间、操作人员、试剂批号应尽量统一，并在元数据中完整记录，以便后续建模时作为协变量纳入。

四、样本分组与随机化策略

分组设计需明确三类变量：处理因素（如药物 vs 对照）、区组因素（如性别、年龄、批次）和随机化单位。随机化应在样本采集前完成，而不是在数据分析时"事后随机"。常用策略是分层随机化：先按关键混杂因素（如性别、体重、采集日期）分层，再在每层内随机分配到各组，从而保证各组在这些因素上均衡。

以下是一份可直接参考的随机化分组表示例（示例数据，非实测）：

表中每个分层内对照与处理各占一半，且两个批次都包含两种组别，实现了分组与批次的平衡。随机数用于在层内排序后交替分配，实际操作中可用随机数生成器完成。采集批次一栏在采样前即确定，避免临时调整造成混杂。

综上，样本采集前的实验设计是一个"先算后做"的过程：用效应量和变异估计样本量，用独立个体保证生物学重复，用正交设计切断批次混杂，用分层随机化保证组间可比。这四步做到位，后续的多组学数据才具备可解释的统计基础。