3. 样本采集工程

代谢组学研究的成败，往往在样本进入质谱仪之前就已经决定了大半。血液、尿液、组织、粪便、唾液、细胞培养液等不同样本，其代谢物组成、酶活水平、微生物背景和基质复杂度差异极大，采集环节若缺乏统一规范，后续再精密的色谱-质谱条件也难以挽回已发生的代谢扰动。本节围绕“采什么、怎么采、何时采、如何防降解”四个工程问题展开。

一、不同样本的标准化采集流程

血液样本是代谢组学最常用的样本类型。血清与血浆的选择直接影响代谢物谱：血清在凝固过程中血小板释放大量代谢物（如5-羟色胺、次黄嘌呤、溶血磷脂），而血浆需依赖抗凝剂。标准化流程建议：静脉穿刺后弃去前2 mL（减少穿刺应激与组织液污染），EDTA管采集后立即轻柔颠倒混匀8～10次，室温静置不超过30 min，4 ℃、1500×g离心10 min，取上清再以12000×g、4 ℃离心10 min去除残余血小板，分装为100～200 μL/管，-80 ℃保存。全流程从穿刺到冻存应控制在60 min内。

尿液样本受饮水、昼夜节律和肾功能影响显著。推荐收集中段尿，避免首段尿的尿道脱落细胞污染。采集后立即记录体积，4 ℃、1000×g离心5 min去除细胞与结晶，上清分装冻存。若无法立即处理，可暂存4 ℃但不超过4 h，或加入叠氮钠（0.02%～0.05%）抑制细菌生长。

组织样本的核心是“快速淬灭”。离体后缺血数分钟内ATP、磷酸肌酸、乳酸即发生剧烈变化。推荐在麻醉状态下快速切取，液氮速冻（<30 s），或采用钳夹冻存法（freeze-clamp）直接以液氮预冷铝钳压扁组织。冻存组织研磨时需在液氮预冷研钵中进行，避免反复冻融。

粪便样本需关注微生物代谢的持续活跃性。推荐新鲜排便于无菌容器，30 min内转移至-80 ℃，或使用OMNIgene·GUT等稳定液常温保存。采样时记录排便时间、饮食状态和抗生素使用史。

二、抗凝剂与防腐剂的选择

抗凝剂本身会引入代谢干扰。EDTA是代谢组学血浆首选，因其对大多数代谢物影响小，但会干扰金属离子依赖的检测；肝素会引入硫酸化多糖背景峰，且促进血小板活化；枸橼酸钠稀释血浆并干扰有机酸分析；氟化钠/草酸钾虽抑制糖酵解，但会显著改变多种代谢物。因此，血浆代谢组学推荐EDTA-K2或EDTA-K3，且需在方法学中明确记录。

防腐剂主要用于抑制离体后的酶促与微生物代谢。尿液常用叠氮钠或硫柳汞；组织与细胞样本可加入预冷甲醇/乙腈直接淬灭；粪便样本可使用含RNA稳定剂的保存液。需注意防腐剂本身不得与后续衍生化试剂或色谱流动相冲突。

三、采集时间点控制

代谢物具有显著的昼夜节律与餐后波动。葡萄糖、胰岛素、氨基酸、胆汁酸等在餐后1～2 h内变化可达数倍。因此，临床代谢组学研究应统一空腹状态（禁食8～12 h）和采血时间窗（如上午7:00～9:00）。若研究设计需要动态监测，应固定相对时间点（如给药后0、0.5、1、2、4、8 h），并记录实际采血时间用于协变量校正。

尿液采集还需考虑昼夜节律，推荐晨尿或24 h尿。24 h尿需记录总尿量并混匀后取样，避免只取某一时段。粪便样本应固定排便周期，如每周同一天同一时段，减少饮食与菌群波动干扰。

四、临床与现场采样注意事项

临床采样需兼顾伦理合规与操作可行性。采血前应确认受试者未服用影响代谢的药物（如他汀类、二甲双胍），并记录吸烟、饮酒、运动等状态。止血带使用时间应<1 min，避免局部缺血导致乳酸、钾离子升高。溶血样本应弃用，因红细胞内高浓度代谢物会严重干扰血浆谱。

现场采样（如野外、社区、床旁）面临冷链缺失的挑战。可采用便携式干冰盒、-20 ℃车载冰箱或化学制冷剂暂存，并记录温度曲线。若无法立即离心，可使用含抗凝剂和稳定剂的采血管（如EDTA+蛋白酶抑制剂），但需在方法学中验证其代谢物回收率。所有样本应使用唯一编码，记录采集时间、地点、操作者、处理延迟时间，形成可追溯的采集日志。

综上，样本采集工程的核心在于“标准化”与“可追溯”。不同样本的采集流程、抗凝剂与防腐剂选择、时间点控制以及现场注意事项，共同决定了代谢组数据的生物学真实性与可比性。只有在采集环节建立严格的工程化规范，后续的提取、衍生化与质谱检测才能获得可靠且可重复的代谢物谱。