2. 样本类型与实验设计

代谢组学研究的成败，往往在样本进入质谱之前就已决定大半。不同生物样本的代谢物组成、浓度范围、基质干扰和稳定性差异极大，而采集时间、个体差异、样本量、重复策略又共同决定了数据能否支撑可靠的生物学结论。本节围绕“选什么样本、什么时候采、怎么控制变异、如何设计重复”四个核心问题展开。

一、常见生物样本的代谢特征与适用场景

血液（血清/血浆）是代谢组学最常用的样本类型。血清与血浆的差异首先来自抗凝剂：EDTA血浆会引入EDTA峰并螯合金属离子，肝素血浆可能干扰某些负离子模式检测，而血清无抗凝剂但凝血过程会释放血小板代谢物。血液代谢物浓度跨度大，从mM级的葡萄糖、乳酸到nM级的胆汁酸、鞘脂，因此常需分模式采集（HILIC测极性代谢物、RPLC测脂质）。血液反映的是全身代谢的“混合池”，适合系统性代谢表型、疾病标志物和药代研究，但对局部组织特异变化不敏感。

尿液以水溶性代谢物为主，浓度受饮水、肾功能和昼夜节律影响显著，常需用肌酐或尿比重归一化。尿液的优势是无创、可重复采集、代谢物种类丰富（尤其适合有机酸、氨基酸衍生物、微生物-宿主共代谢物），适合大规模队列和纵向监测。组织样本（肝、肾、脑、肿瘤等）代谢物浓度高、周转快，但取样后缺血时间对ATP、乳酸、琥珀酸等影响极大，必须快速淬灭。细胞样本需控制培养基残留、细胞数量和淬灭效率，适合机制研究和药物干预。粪便样本承载肠道菌群代谢产物（短链脂肪酸、次级胆汁酸、色氨酸衍生物），均一化困难，需冷冻研磨后称重取样。植物样本则受品种、器官、发育阶段、光照和胁迫影响，次生代谢物丰富，取样需固定部位与时间。

二、采集时间与个体差异控制

采集时间是代谢组学中最容易被忽视却影响巨大的变量。血液中葡萄糖、胰岛素、皮质醇、氨基酸等均呈现明显的昼夜节律，若病例组与对照组采样时间不匹配，差异可能完全来自节律而非疾病。因此临床研究应固定采血时间窗（如晨起空腹 7:00–9:00），并记录末次进食时间。尿液同样受昼夜节律影响，晨尿与随机尿的代谢谱差异显著，纵向研究应统一采集时段。粪便样本还需考虑排便频率和肠道转运时间，建议记录 Bristol 粪便分型。

个体差异控制包括：年龄、性别、BMI、饮食、药物、吸烟、运动等。饮食是最大的短期变异来源，标准做法是要求受试者空腹 8–12 h，并在实验前 24–48 h 避免摄入咖啡因、酒精和高脂饮食。药物会直接改变代谢谱，需详细记录并尽可能设置洗脱期。对于动物实验，应控制品系、周龄、体重、饲养环境和饲料批次，同一实验尽量使用同批次动物。细胞实验需控制传代次数、汇合度和培养基批次。

三、实验设计原则与重复策略

代谢组学实验设计应遵循随机化、区组化和重复三原则。随机化指样本的处理顺序、提取批次、进样顺序均应随机排列，避免将病例组和对照组分别集中处理，否则批次效应会与分组效应完全混淆。区组化是将同一天或同一批次处理的样本作为一个区组，在统计模型中纳入区组因子，从而分离批次变异。若样本量较大，可采用“区组内随机”策略，每个区组包含各组样本。

重复策略分为技术重复和生物学重复。技术重复用于评估分析精密度，通常对同一样本重复提取和进样 3–6 次，要求关键代谢物峰面积 CV ≤ 15%（LC-MS）或 ≤ 20%（GC-MS）。生物学重复用于推断群体差异，细胞和动物实验通常 n ≥ 6，人群研究因个体差异大，n ≥ 30 才能获得较稳定的统计效力。需要注意的是，技术重复不能替代生物学重复，增加技术重复只提高测量精度，不增加生物学推断的把握度。

四、可执行的样本采集与设计检查清单

以下清单可直接用于实验前的方案核对，字段根据实际研究类型增删。

在实际操作中，建议先做小规模预实验（pilot study），用 3–5 个样本验证采集、淬灭、提取和检测流程的可行性，评估 QC 精密度和代谢物覆盖度，再确定最终样本量和分组策略。预实验还能帮助发现溶血、尿比重极端、组织缺血等异常样本，及时调整方案。只有把样本类型、采集时间、个体差异控制和实验设计作为一个整体来规划，后续的统计分析和生物学解释才有可靠的基础。