2. 细胞培养基础回顾

工艺放大不是把摇瓶体积简单放大，而是把一套由细胞特性决定的培养策略，在更大尺度上重新实现。理解 CHO、HEK293、杂交瘤等常用细胞系的生长代谢差异，以及贴壁与悬浮、批式与补料批式与灌流之间的取舍逻辑，是后续放大设计的前提。

一、三类常用细胞系的生长代谢特性

CHO 细胞是生物制药中最主流的表达宿主，属于贴壁或悬浮适应性均可的成纤维样细胞。工业上普遍使用悬浮驯化后的 CHO（如 DG44、CHO-K1 衍生株），倍增时间约 18～24 h，可在化学成分明确的无血清培养基中高密度生长。其代谢特点是葡萄糖消耗与乳酸生成并存，在葡萄糖过量时易出现"乳酸溢流"；谷氨酰胺代谢会产生氨，两者都是抑制性副产物。CHO 的优势在于糖基化模式接近人源、可进行高密度补料培养，抗体表达量可达 3～10 g/L。

HEK293 细胞来源于人胚肾，倍增时间约 20～30 h，既可贴壁也可在无血清条件下悬浮培养（如 293F、293S）。它最突出的能力是瞬时转染表达效率高，常用于病毒载体、重组蛋白的快速制备。HEK293 对剪切较敏感、易聚团，悬浮培养时通常需要 Pluronic F-68 等保护剂，且高密度下代谢副产物积累更快，因此更适合短周期、高价值的瞬时表达任务，而非长期高密度补料工艺。

杂交瘤细胞由 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而来，用于单克隆抗体生产。它可悬浮生长，倍增时间约 15～20 h，但细胞较脆弱、对剪切和渗透压变化敏感，且需要血清或血清替代物支持，无血清驯化难度较大。杂交瘤的抗体表达量通常低于 CHO，但因其分泌效率高、产物稳定，仍用于部分诊断抗体和小规模生产。

二、贴壁培养与悬浮培养的差异

贴壁培养依赖细胞与基质表面的黏附，细胞在培养瓶、滚瓶或微载体表面铺展生长。其优点是细胞状态直观、易于观察，适合 HEK293 贴壁转染和原代细胞；缺点是单位体积表面积有限，放大时需增加微载体或多层培养板，操作复杂且难以在线监测。悬浮培养则让细胞自由分布于培养基中，放大只需增加反应器体积，搅拌、通气、pH 和溶氧均可在线控制，是 CHO 和杂交瘤工业生产的首选。

从放大角度看，贴壁培养的"放大"本质是扩大表面积，而悬浮培养的"放大"是扩大体积并维持混合与传质。悬浮培养需要解决剪切保护、起泡、细胞聚团等问题；贴壁培养则要关注微载体浓度、贴附均匀性和消化传代的一致性。若目标产物需要长期高密度生产，应优先选择悬浮驯化细胞株。

三、批式、补料批式与灌流模式的选择依据

批式培养是一次性加入全部培养基，培养过程中不补料也不排液。操作最简单、污染风险最低，但营养耗尽和副产物积累会限制细胞密度与产物浓度，通常用于种子扩增或小规模筛选。

补料批式是在培养过程中分批补加浓缩营养液，同时不连续排液。它通过补充葡萄糖、氨基酸和谷氨酰胺，延长细胞生长期并提高产物积累，是当前 CHO 抗体生产的主流模式。典型补料策略从第 3 天开始，每天补加培养体积的 2%～5%，持续至第 10～14 天，活细胞密度可达 10～20×10⁶ cells/mL，抗体滴度显著高于批式。

灌流培养是连续加入新鲜培养基并连续排出含产物的培养液，通过细胞截留装置（如交替切向流 ATF、切向流过滤 TFF）将细胞保留在反应器内。它可维持高活细胞密度（>50×10⁶ cells/mL）和稳定产物质量，适合不稳定蛋白或需要连续收获的工艺，但设备复杂、培养基消耗大、长期无菌运行风险高。

四、放大前的判断路径

面对一个具体项目，可按以下顺序判断：先看产物是否需要人源糖基化，若是则优先 CHO；再看工艺周期，若需数周内快速获得材料，HEK293 瞬时表达更合适；若产物为诊断抗体且规模不大，杂交瘤仍可用。确定细胞系后，再根据产物稳定性选择模式：稳定产物用补料批式，不稳定或需连续收获用灌流，早期筛选用批式。

需要强调的是，贴壁与悬浮并非绝对对立。许多细胞系可通过驯化从贴壁转为悬浮，但驯化过程可能改变糖基化谱和生长特性，放大前应重新验证产物质量。同样，补料批式与灌流之间也存在混合模式，如浓缩补料灌流，应根据实际设备与成本灵活选择。