4. 种子扩大培养与接种技术
种子扩大培养的本质，是把一支保存于冷冻管或斜面中的菌种，经过逐级放大，最终获得数量足够、活力旺盛、代谢状态一致的接种物。发酵罐的规模可能从几吨到几百吨，而种子罐通常只有发酵罐体积的 1%～10%，因此必须通过“摇瓶→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐”的逐级扩培，让菌体在每一级都处于对数生长期中后期，才能保证接入发酵罐后迅速占据优势、缩短迟滞期。
逐级扩培的工艺参数
摇瓶阶段是种子活化的起点。以细菌为例，常用 250 mL 三角瓶装液 25～50 mL，装液量过大会导致溶氧不足、菌体生长缓慢；装液量过小则单瓶菌体总量不足。摇床转速一般 180～220 r/min，温度按菌种设定（如枯草芽孢杆菌 37 ℃、谷氨酸棒杆菌 30～32 ℃）。培养时间通常 8～16 h，以 OD600 达到 0.6～1.0 或镜检菌体形态整齐、无杂菌为准。
种子罐阶段的核心参数包括接种量、通气量、搅拌转速、温度和 pH。一级种子罐接种量一般为 0.5%～2%（体积分数），二级种子罐接种量可提高到 5%～10%。通气比（VVM，单位体积每分钟通气量）在细菌种子罐中常取 0.5～1.5，放线菌或真菌种子罐可适当提高。搅拌转速需兼顾溶氧与剪切力，细菌种子罐常用 150～300 r/min。种子罐的 pH 一般通过补加酸、碱或碳源控制在菌体最适生长区间，例如谷氨酸棒杆菌种子罐 pH 控制在 6.8～7.2。
逐级扩培的放大比例通常为 5～10 倍。若发酵罐为 50 m³，可按摇瓶 50 mL→一级种子罐 50 L→二级种子罐 500 L→发酵罐 50 m³ 的路径设计。每一级的种龄必须严格控制，种龄过短则菌体数量不足，种龄过长则菌体进入稳定期甚至衰亡期，接种后迟滞期延长、产率下降。
接种量、种龄与接种方式的影响
接种量对发酵的影响体现在迟滞期和代谢流分配上。接种量过小，菌体需要更长时间适应新环境，迟滞期延长，杂菌污染风险增大；接种量过大，虽然能缩短迟滞期，但会带入较多代谢副产物，且菌体生长过快可能导致溶氧不足、代谢副产物积累。以谷氨酸发酵为例，接种量从 5% 提高到 10%，迟滞期可缩短 2～4 h，但若溶氧跟不上，产酸反而下降。因此接种量需要与种子罐和发酵罐的供氧能力匹配。
种龄的选择原则是“宁嫩勿老”。种龄过老，菌体已进入稳定期或衰亡期，细胞内储能物质消耗、酶活下降，接入发酵罐后恢复生长慢，产物合成能力弱。种龄过嫩，菌体数量不足，同样延长迟滞期。实际操作中，以菌体处于对数生长期中后期、OD 或干重达到预定值、镜检形态整齐为判断依据。
接种方式主要有火焰接种、压差接种和管路接种。火焰接种适用于小型种子罐，操作简单但污染风险较高；压差接种利用无菌空气或蒸汽压差将种子液压入发酵罐，适用于中大型发酵罐，污染风险低；管路接种通过无菌管路连接种子罐与发酵罐，适合自动化程度较高的车间。无论哪种方式，接种前都需对接种口、管路进行灭菌，接种过程中保持正压，防止外界空气进入。
种子异常问题的排查与处理
种子异常最常见的是生长缓慢、杂菌污染和菌体形态异常。生长缓慢时，首先检查温度、pH 和溶氧是否在设定范围内，再检查培养基灭菌是否彻底、营养是否充足。若 pH 异常下降，可能是碳源过量或染菌产酸；若 pH 异常上升，可能是氮源过量或菌体自溶。杂菌污染时，应立即取样镜检和平板涂布，确认污染类型，同时检查灭菌操作、接种管路和空气过滤器。若污染严重，应废弃该批种子，对种子罐和管路进行彻底灭菌后重新接种。
菌体形态异常表现为菌体变长、膨大、空泡增多或出现异形。常见原因是种龄过长、溶氧不足或剪切力过大。处理方法是调整种龄、提高通气量或降低搅拌转速。若形态异常伴随 OD 下降，说明菌体已进入衰亡期，应废弃并重新扩培。
种子扩大培养的最终目标，是让发酵罐在接入种子后能够迅速进入产物合成期。因此，每一级的接种量、种龄和培养条件都不是孤立的，而是需要与下一级的规模和供氧能力匹配。实际生产中，建议对每一级种子建立批记录，记录 OD、pH、镜检结果和种龄，形成可追溯的种子质量档案，为后续批次提供参考。