2. 菌种与种子扩大培养
发酵放大的第一步不是反应器，而是种子。冻存管里那 1 mL 菌液，要经过解冻、活化、斜面或平板分离、摇瓶扩培、种子罐扩培，最终以合适的菌体浓度、生理状态和体积接入发酵罐。种子质量决定了发酵的起跑线：接种龄过短，菌体尚未进入对数期，延迟期长；接种龄过长，菌体已进入稳定期甚至衰亡期，产酶或产代谢物能力下降。因此，种子扩大培养的核心是三个变量——活化状态、扩培级数、接种龄与接种量。
一、从冻存管到活化：先让菌“醒过来”
冻存管通常保存在 −80 ℃ 或液氮中，菌体处于低温休眠状态。直接接入摇瓶会因冷休克和膜损伤导致延迟期延长，因此必须先活化。以细菌为例，常见做法是：从 −80 ℃ 取出冻存管，置于 37 ℃ 水浴中快速解冻 1～2 min，至冰晶刚好消失即取出，避免长时间高温损伤。用 75% 酒精擦拭管口后，在无菌条件下取 100 μL 菌液，接种到 5 mL 液体培养基中，37 ℃、200 r/min 培养 8～12 h，此为一级活化。若菌种为放线菌或霉菌，则改用斜面或平板活化：取冻存孢子悬液涂布到高氏一号或 PDA 平板上，28～30 ℃ 培养 3～7 d，待孢子成熟后用无菌水洗下制成孢子悬液。
活化的判断标准不是“变浑浊”就够，而是看菌体形态和纯度。细菌应镜检为革兰氏染色均一、无杂菌；霉菌应观察孢子梗和孢子形态正常。若活化后菌体浓度偏低（OD600 < 0.3），可再转接一次新鲜液体培养基，但连续活化不宜超过 2 代，否则容易发生质粒丢失或生产性能退化。
二、扩培级数设计：不是越多越好
从摇瓶到种子罐，再到发酵罐，扩培级数取决于接种体积比和种子罐与发酵罐的容积差。工业上常用 10 倍体积放大原则：每一级接种量控制在 1%～10%（体积分数），使菌体在每一级都有足够的对数生长期。若发酵罐为 10 m³，种子罐为 1 m³，则种子罐接种量按 5% 计算需要 50 L 种子液；这 50 L 可由 5 L 摇瓶或小种子罐提供，再往前由 500 mL 摇瓶扩培。级数过少，单级放大倍数过大，菌体在种子罐中延迟期长、易染菌；级数过多，则操作繁琐、菌体生理状态在多次传代后可能退化。
一个实用的级数判断方法是：从冻存管到发酵罐，总扩培倍数不超过 105～106。例如冻存管 1 mL → 摇瓶 50 mL（50 倍）→ 小种子罐 5 L（100 倍）→ 种子罐 500 L（100 倍）→ 发酵罐 10 m³（20 倍），总倍数约 107，偏大，可考虑减少一级或提高各级接种量。实际设计中，还应结合菌体比生长速率 μ 估算：若 μ = 0.4 h−1，每级培养 4～6 h 可增殖约 5～10 倍，因此每级体积放大 5～10 倍较为稳妥。
三、接种龄：在对数期中期“出手”
接种龄指种子液培养到接入下一级或发酵罐时所经历的时间。判断接种龄不能只看钟表，而要看菌体生理状态。最可靠的指标是 OD600 或细胞干重，并结合镜检。以大肠杆菌为例，37 ℃ 培养时，OD600 达到 0.6～0.8 通常对应对数中期，此时比生长速率接近最大值，菌体代谢活跃、质粒拷贝数稳定，是接种的最佳窗口。若等到 OD600 > 1.5，菌体已接近稳定期，再接入发酵罐会延长延迟期，且可能因乙酸积累抑制后续表达。
对于霉菌和放线菌，接种龄常以孢子浓度或菌丝体形态判断。例如黑曲霉种子罐培养 18～24 h，镜检菌丝粗壮、分支多、无空泡，即为适宜接种龄。若菌丝出现断裂或大量空泡，说明已进入衰亡期，不宜再接种。
四、接种量优化：兼顾延迟期与成本
接种量过小，菌体需要更长时间才能达到足够浓度，延迟期延长，染菌风险增加；接种量过大，虽然延迟期缩短，但会带入较多代谢副产物和老化菌体，且种子罐体积占用大、成本高。工业上通常通过梯度实验确定最佳接种量：在摇瓶水平设置 1%、3%、5%、8%、10% 五个接种量，固定培养温度和转速，每隔 2 h 取样测 OD600，绘制生长曲线，比较达到目标 OD 所需时间和最终菌体浓度。
一个合理的判断标准是：选择延迟期最短且最终菌体浓度不低于最高水平 90% 的最小接种量。例如某芽孢杆菌发酵中，5% 接种量在 8 h 达到 OD600 4.0，10% 接种量在 7 h 达到 4.2，但 5% 接种量节省了种子液体积和种子罐运行成本，因此 5% 更优。若发酵产物为次级代谢物，还需考虑接种量对产物合成的影响，有时稍低的接种量反而有利于产物积累。
五、从摇瓶到种子罐的衔接要点
摇瓶种子接入种子罐时，需注意温度、pH 和溶氧的过渡。摇瓶培养温度通常与种子罐一致，但摇瓶无法控制 pH，若摇瓶培养过程中 pH 降至 5.5 以下，接入种子罐后菌体需要重新适应。因此，摇瓶培养基可适当增加缓冲盐（如磷酸盐）或初始 pH 调至 7.2～7.4。种子罐接种后，应尽快将温度、pH 和通气量调整到设定值，并在前 2 h 内每 30 min 取样观察，确认菌体进入对数期。
种子罐的接种量一般控制在 5%～10%，若种子罐体积为 500 L，装液量 300 L，则需摇瓶种子液 15～30 L。实际操作中，可将多个摇瓶合并到一个无菌接种瓶中，通过火焰或无菌管路接入种子罐。接种后立即取样测 OD600，作为种子罐起始浓度，后续每隔 2 h 取样，绘制生长曲线，待 OD 达到目标值且镜检正常时，即可接入发酵罐。
六、常见问题与判断依据
| 现象 | 可能原因 | 处理方向 |
|---|---|---|
| 活化后 12 h 仍无明显浑浊 | 冻存菌体活力低、解冻温度不当、培养基不合适 | 重新解冻一支冻存管，检查培养基和温度，必要时延长活化时间 |
| 种子罐延迟期超过 4 h | 接种龄过老、接种量偏低、温度/pH 不适 | 下一批提前接种，提高接种量至 8%～10%，检查控温控 pH 系统 |
| 镜检发现杂菌 | 无菌操作不严、培养基灭菌不彻底、种子带菌 | 废弃该级种子，重新灭菌，从冻存管重新活化 |
| 菌体浓度达标但产物合成低 | 接种龄处于稳定期、质粒丢失、副产物积累 | 提前接种，降低传代次数，检查质粒稳定性 |
种子扩大培养的本质是用可控的逐级放大，把少量冻存菌体变成足够数量、生理状态一致的种子液。活化决定菌体能否恢复活力，扩培级数决定放大是否平稳，接种龄和接种量决定接入发酵罐后能否快速进入对数期。三者相互关联：级数越多，接种龄越难统一；接种量越大，延迟期越短，但成本越高。实际工作中，应通过小试摇瓶实验建立本菌种的生长曲线和接种量梯度数据，再据此设计种子罐的级数和接种参数，而不是照搬其他菌种的经验值。