2. 细胞株来源与工程化改造
哺乳动物细胞表达系统的起点是宿主细胞。宿主细胞的遗传背景、生长特性、糖基化能力和可放大性，直接决定了后续工艺路线的可行边界。工业界常用的宿主细胞主要有四类：CHO、HEK293、NS0 和 BHK。它们并非可以随意互换，而是各自对应不同的产品类型与生产规模。
CHO 细胞是治疗性蛋白生产的主力，约占已上市生物药的大多数。它的优势在于悬浮驯化成熟、可在化学成分明确培养基中高密度生长、具备人源化糖基化模式，且内源蛋白分泌量低，便于下游纯化。常用的衍生株包括 DG44（dhfr 缺陷）、DUKX-B11、CHO-K1 及其悬浮亚克隆 CHO-S。HEK293 来源于人胚肾，转染效率极高，适合瞬时表达和病毒载体生产，但其贴壁倾向强、糖基化含较多 Neu5Gc 唾液酸，作为长期生产宿主存在安全性与一致性顾虑。NS0 是小鼠骨髓瘤细胞，缺乏内源谷氨酰胺合成酶（GS），天然适合 GS 筛选系统，常用于抗体表达，但会分泌小鼠源糖基化抗原决定簇。BHK-21 来源于仓鼠肾，是口蹄疫疫苗和部分凝血因子生产的经典宿主，贴壁与悬浮形态均有使用。
选择宿主时，应围绕产品类型、目标产量、糖基化要求、监管接受度和放大规模综合判断。例如，单抗产品优先考虑 CHO；需要快速获得克级蛋白用于早期评价时，HEK293 瞬时表达更高效；而疫苗类产品则可能沿用 BHK 平台。
稳定表达细胞株的构建，核心是把外源基因整合进宿主基因组并维持长期表达。主流策略是共转染表达载体与筛选标记载体，在选择性压力下富集整合成功的细胞。以 CHO DG44 为例，常用 dhfr 系统：将目标基因与 dhfr 基因共转染至 dhfr 缺陷型宿主，在缺乏核苷的培养基中，只有整合了 dhfr 的细胞才能存活。随后逐步提高甲氨蝶呤（MTX）浓度，从 20 nM 到 100 nM、500 nM 甚至 1 μM，dhfr 基因连同旁侧的目标基因一起被扩增，拷贝数可从个位数提升到数十甚至上百，表达量随之显著上升。这一过程称为基因扩增，是 CHO 平台提高产量的经典手段。
另一条主流路线是 GS 系统，适用于 NS0 和 CHO-GS 细胞。谷氨酰胺合成酶可将谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺，细胞在无谷氨酰胺培养基中依赖 GS 才能生长。使用甲硫氨酸亚砜亚胺（MSX）作为抑制剂，可筛选出高表达 GS 的细胞，同样通过提高 MSX 浓度实现共扩增。GS 系统的优势在于筛选周期较短，且部分细胞可在无 MSX 条件下维持高表达。
筛选完成后，需要通过有限稀释法或半固体培养基法分离单克隆。单克隆性至关重要，因为不同克隆的表达量、糖基化谱和稳定性差异巨大。分离后通常评估 100～500 个克隆，选取表达量高、生长良好、产物质量符合预期的前 5～10 个进入稳定性传代研究。稳定性研究一般要求连续传代 60 代以上，监测表达量和基因拷贝数的漂移。若表达量在传代过程中下降超过 30%，该克隆通常不予考虑。
教学示例：CHO DG44 稳定株构建关键参数（示例值，非实测）
- 转染方式：电转，质粒用量 40 μg，细胞密度 1×10⁷ /mL
- 筛选压力：MTX 起始 20 nM，逐步提升至 500 nM
- 单克隆分离：有限稀释法，96 孔板，铺板密度 0.5 个/孔
- 克隆评估：第 14 天检测表达量，选取前 10% 克隆
- 稳定性传代：60 代，每 10 代检测表达量与拷贝数
- 细胞库：构建 MCB 后，连续传代至 WCB，冻存密度 1×10⁷ /mL
细胞库建立是合规生产的硬性要求。两级库体系包括主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）。MCB 由单一克隆扩增后分装冻存，需进行无菌、支原体、内外源病毒、致瘤性等检定。WCB 由 MCB 复苏后扩增制备，检定项目可适当简化，但必须确认遗传稳定性与表达一致性。细胞库的传代代数应明确限定，超出代次需重新验证。所有冻存管应记录批号、代次、冻存日期和位置，并保存于液氮或 −150°C 以下。
选择宿主时，若产品需要复杂人源糖基化且计划商业化生产，CHO 是默认首选；若仅用于早期研究或病毒载体，HEK293 更高效；若已有 NS0 或 BHK 平台历史数据，可沿用并做好糖基化表征。
工程化改造不仅限于表达载体。宿主细胞的糖基化通路也可被编辑，例如敲除 FUT8 基因获得去岩藻糖化抗体，增强 ADCC 效应；或过表达 GnTIII 引入平分型 GlcNAc。这些改造需在细胞株构建早期完成，并纳入稳定性与合规评估。无论采用哪条路线，最终目标都是获得一株表达量高、质量稳定、可放大、可合规的工程细胞株。