3. 检测样本的获取与处理
编辑效率检测的第一步不是跑PCR，而是拿到一份“能代表编辑事件真实比例”的核酸样本。不同样本类型在取材、裂解、提取和均一性上差异极大，若样本本身不均一或存在等位基因丢失，后续即使qPCR、NGS再精确，也会得到系统性偏差。本节按样本来源分类说明取材与处理要点，并给出基因组DNA、RNA提取的关键控制点与重复设计方法。
一、四类样本的取材与处理差异
细胞系是最易标准化的样本。贴壁细胞用胰酶消化后计数，取1×10⁶～5×10⁶个细胞离心弃上清，PBS洗一次即可进入裂解。关键点是：编辑后需传代2～3次再取样，避免残留的RNP或质粒造成假阳性；若用质粒转染，应至少换液两次。悬浮细胞直接离心收集，注意不要过度离心导致DNA断裂。
原代细胞（如T细胞、HSC、成纤维细胞）数量有限、不可无限扩增，取材量需精打细算。以T细胞为例，编辑后48～72 h取2×10⁵～5×10⁵个细胞即可满足一次NGS扩增子测序；若同时做RNA分析，建议分出一半单独裂解。原代细胞易凋亡，裂解前应镜检活率，活率低于70%时编辑效率数据参考价值下降。
组织样本（肝、肌肉、肿瘤）需先物理破碎。推荐液氮研磨或钢珠震荡，每10～30 mg组织加200～400 μL裂解液。组织中的胶原、多糖和血红素是PCR抑制物，提取时建议增加蛋白酶K消化时间至3～6 h，并用柱纯化而非简单沉淀。肿瘤样本还需注意取材区域：应避开坏死区，并在病理确认后取编辑靶向区域，否则测到的是正常细胞背景。
植物材料（叶片、愈伤、种子）细胞壁厚，需液氮研磨成粉。叶片取50～100 mg，加入含CTAB或SDS的提取缓冲液，65℃水浴30～60 min。植物多糖和多酚含量高，可在裂解液中加入2% PVP和β-巯基乙醇。若做编辑效率检测，建议取同一植株不同叶片混合，减少嵌合体带来的偏差。
二、基因组DNA提取：从裂解到可扩增模板
gDNA提取的核心目标是获得“完整、无抑制物、浓度可定量”的模板。以细胞系为例，推荐流程为：细胞沉淀加200 μL PBS重悬，加200 μL裂解液（含10 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM EDTA、0.5% SDS、200 μg/mL蛋白酶K），55℃消化1～2 h；加等体积异丙醇沉淀，70%乙醇洗两次，最后溶于50 μL TE或去离子水。若用硅胶柱，则按柱说明书结合液比例操作，洗脱体积可降至30 μL以提高浓度。
组织样本需额外注意：研磨后先加裂解液再消化，避免组织块直接冻存导致DNA降解；肝组织富含血红素，可在裂解后加CTAB/NaCl去除。植物材料建议用改良CTAB法：65℃水浴后加氯仿:异戊醇（24:1）抽提两次，异丙醇沉淀，再用70%乙醇洗。提取完成后，用Qubit或荧光染料法测浓度，A260/280在1.8～2.0之间，A260/230＞1.8表示无多糖/酚类残留。取100～200 ng做琼脂糖凝胶电泳，主带应大于10 kb，若出现明显拖尾说明降解。
三、RNA提取：编辑效率的转录层面验证
当需要检测编辑对转录本的影响（如移码、剪接变化）时，需提取总RNA。细胞系可用TRIzol法，每1×10⁶细胞加1 mL TRIzol，氯仿分层后取水相，异丙醇沉淀。原代细胞量少时建议用柱式微量RNA提取试剂盒，洗脱体积10～15 μL。组织样本需在液氮中研磨后直接加TRIzol，避免反复冻融。植物材料因多糖多酚高，推荐用植物专用RNA提取试剂盒，或TRIzol法加2% PVP和β-巯基乙醇。
RNA质检关键指标：Qubit RNA浓度≥50 ng/μL，A260/280 1.9～2.1，A260/230＞1.8；用Bioanalyzer或琼脂糖凝胶检测完整性，真核样本RIN＞7，植物样本RIN＞6即可用于反转录。反转录时取500 ng～1 μg总RNA，用随机引物或Oligo(dT)合成cDNA，再用于编辑位点扩增。注意：RNA样本必须无gDNA污染，可设置无逆转录酶对照（-RT）确认。
四、样本均一性与重复设计
编辑效率检测的偏差常来自样本不均一。细胞系需确保取样时细胞充分重悬，避免贴壁细胞局部密度差异；原代细胞若为混合群体，应记录细胞组成。组织样本的嵌合体问题最突出：同一块组织不同区域编辑效率可能相差数倍，建议取多个位点混合，或至少取3个独立小块分别提取后等量混合。植物叶片同样存在嵌合，建议取同一植株不同叶位混合，或对单株分别检测后取平均。
重复设计上，建议每个样本至少3个技术重复（同一次提取分3管扩增），独立编辑实验至少2个生物学重复（不同批次转染/转化）。每块96孔板需包含：阴性对照（未编辑样本）、空白对照（无模板）、阳性对照（已知编辑效率样本）。若技术重复间Ct值或编辑效率差异＞15%，应检查提取质量或重新取样。最终报告应注明样本类型、取材量、提取方法、质检数据和重复次数，使编辑效率数据可追溯、可复现。