3. 基因组DNA提取与质量控制
全外显子测序（WES）对起始DNA的质量要求远高于普通PCR或Sanger测序。原因在于WES的第一步是文库构建，而文库构建中的末端修复、接头连接、PCR扩增都对DNA的完整性、纯度和浓度高度敏感。一个260/280比值看似合格的样本，如果存在严重降解或抑制剂残留，仍可能在建库后表现为插入片段偏短、重复率升高、外显子覆盖不均，甚至无法通过上机前的质控。因此，本节把DNA提取、效率优化、浓度纯度检测、完整性评估和降解补救作为一个完整链条来讲。
不同样本来源的提取方法选择
WES常见样本来源包括外周血、唾液、口腔拭子、培养细胞、新鲜组织、FFPE组织和干血斑。不同来源的细胞结构、蛋白含量、多糖多酚含量和交联程度差异很大，提取策略必须区别对待。
- 外周血：首选柱式或磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒。EDTA抗凝优于肝素抗凝，因为肝素是Taq酶抑制剂，残留会抑制后续PCR。若用肝素管，需增加洗涤次数或使用肝素酶处理。
- 唾液与口腔拭子：这类样本含大量细菌DNA和黏蛋白，建议选用带溶菌酶预处理或专门针对口腔样本的试剂盒，否则人源DNA占比可能偏低，影响外显子捕获效率。
- 培养细胞：细胞量可控，可用酚氯仿法或柱式法。关键是充分裂解和去除RNA，可加入RNase A 37℃处理15分钟。
- 新鲜组织：需先液氮研磨或使用组织匀浆器，裂解液中蛋白酶K消化时间可延长至3小时以上，确保组织完全消化。
- FFPE组织：DNA存在交联和片段化，建议使用专门针对FFPE的提取试剂盒，并在裂解后增加95℃去交联步骤（约30分钟），但需注意高温会进一步加剧片段化。
- 干血斑：打孔后需充分洗脱，提取量通常较低，建议多片合并提取。
提取效率优化
提取效率的核心是裂解充分、蛋白去除干净、DNA损失少。实际操作中可从以下几方面优化：
- 裂解：蛋白酶K用量按样本类型调整，血液样本通常20 μL（20 mg/mL）即可，组织样本可加倍；裂解温度56℃过夜对多数组织更彻底。
- 结合与洗涤：柱式法中，上柱前加入等体积无水乙醇可提高短片段回收率；洗涤时避免乙醇残留，否则会抑制后续酶反应。
- 洗脱：洗脱体积不宜过大，否则浓度偏低。常规洗脱50～100 μL，若浓度不足可二次洗脱或真空浓缩。
- 减少剪切：操作中避免剧烈涡旋和反复冻融，大片段DNA容易被机械剪切打断。
浓度与纯度检测
浓度检测推荐使用荧光染料法（如Qubit），因为紫外分光光度法（NanoDrop）会受RNA和游离核苷酸干扰，读数偏高。纯度则用260/280和260/230两个比值判断：
| 指标 | 合格范围 | 异常含义 |
|---|---|---|
| 260/280 | 1.8～2.0 | <1.8提示蛋白或酚污染；>2.0提示RNA残留 |
| 260/230 | 2.0～2.2 | <2.0提示盐、糖、乙醇或胍盐残留 |
| Qubit浓度 | ≥20 ng/μL（建库推荐） | 过低需浓缩或重新提取 |
注意：NanoDrop与Qubit结果差异超过2倍时，应以Qubit为准，并排查RNA污染或盐残留。
完整性评估
完整性评估最直接的方法是琼脂糖凝胶电泳和片段分析仪（如Agilent TapeStation或Bioanalyzer）。电泳中，高质量基因组DNA应呈现单一、清晰的高分子量主带，无明显弥散拖尾。片段分析仪可给出DIN值（DNA Integrity Number），DIN≥7通常认为适合WES建库，DIN在4～7之间需谨慎，DIN<4则强烈提示降解。
此外，还可通过长片段PCR扩增（如扩增10 kb片段）来验证模板完整性。若长片段扩增失败而短片段成功，说明DNA存在断裂。
降解样本的补救策略
降解样本并非完全不能用，但需要调整建库策略。若DIN在4～7之间，可尝试以下补救：
- 重新提取：若原始样本仍有留存，换用更温和的提取方法，减少机械剪切和高温步骤。
- 浓缩与纯化：用纯化柱或AMPure XP磁珠进行浓缩，同时去除盐和抑制剂。磁珠比例可调整为1.8×，以保留更多短片段。
- 调整建库参数：降解DNA片段偏短，可省去或缩短片段化步骤，直接进行末端修复和接头连接；PCR循环数可适当增加至10～12个循环，但需注意重复率上升。
- FFPE样本：建议使用专门针对FFPE的建库试剂盒，其末端修复和连接体系对损伤碱基有一定耐受性。
- 重新采样：若DIN<4且样本无法重新提取，建议重新采样，因为强行建库往往得到低质量数据，浪费测序成本。
总结来说，WES的DNA质控应形成“提取—检测—评估—补救—复检”的闭环。提取方法要匹配样本来源，效率优化要围绕裂解和回收，浓度纯度以Qubit和比值双指标判断，完整性以DIN和电泳为准，降解样本则根据程度选择重新提取、纯化浓缩或调整建库策略。只有把这一链条走通，才能为后续文库构建和外显子捕获提供可靠起点。