2. 样本采集与处理工程
全外显子测序（WES）的数据质量，在很大比例上并不由建库或测序环节决定，而是由样本进入实验室之前的那一段“看不见的流程”决定。同一台测序仪、同一套建库试剂，用一份 4 ℃ 放置 72 小时的 EDTA 抗凝血和一份新鲜采集并及时分离的血样，最终得到的覆盖均一性、重复率、外显子捕获效率可能相差一个档次。本节按“样本类型—采集规范—运输与保存—质量评估—常见问题处理”的工程链条展开，重点讲清每一步的可执行参数与判读依据。
一、四类样本的采集规范与关键差异
血液样本是 WES 的首选来源，核酸产量高、质量稳定。常规采用 EDTA-K2 抗凝管（紫帽），采血量 2～5 mL；婴幼儿或需保留白细胞活性时可用 EDTA 管配合后续冻存。需注意：肝素抗凝会强烈抑制后续 PCR 与酶切反应，严禁使用肝素管；枸橼酸钠管因稀释效应和体积限制，也不作为 WES 首选。采血后应轻柔颠倒混匀 8～10 次，避免剧烈振荡导致白细胞破裂释放基因组 DNA 造成背景升高。
唾液样本适合无创、远程采集场景，但唾液中含有大量口腔上皮脱落细胞、细菌和食物残渣，人源 DNA 占比可能低至 30%～70%。采集前 30 分钟禁食、禁水、禁烟，采集时使用专用唾液采集器（含稳定液），采集量通常 2 mL 左右。唾液样本的常见风险是细菌 DNA 污染和 DNA 降解，因此对后续建库的文库复杂度与外显子捕获特异性要求更高。
新鲜组织样本（手术切除或穿刺）需在离体后尽快处理。理想流程是：离体后 30 分钟内切取目标区域，去除坏死、脂肪和纤维组织，切成约 0.5 cm³ 小块，液氮速冻后转 −80 ℃ 保存，或直接投入 RNAlater/福尔马林固定。若用于 DNA 层面 WES，液氮速冻优于福尔马林固定，因为后者会引起 DNA 交联和片段化。
FFPE 样本是回顾性研究的主力，但也是质量最不可控的一类。石蜡包埋过程中的甲醛固定会导致 DNA 与蛋白交联、胞嘧啶脱氨（C→T 假突变）以及片段化。FFPE 样本的 DNA 通常片段集中在 100～300 bp，DV200（大于 200 nt 的片段占比）是比 DIN 更实用的指标。取材时应由病理医师确认肿瘤细胞含量，一般要求肿瘤细胞占比 ≥ 20%，必要时进行宏观或显微切割富集。
二、运输与保存：温度、时间与冻融次数
运输环节的核心变量是温度和时间。EDTA 抗凝血在 4 ℃ 条件下 24 小时内到达实验室，基因组 DNA 完整性基本不受影响；若超过 48 小时，白细胞会逐渐凋亡，DNA 出现片段化，DIN 可能从 8 以上降到 6 以下。唾液样本因含稳定液，常温可稳定 7 天左右，但高温（> 30 ℃）会加速降解。新鲜组织必须干冰运输，干冰量应保证到达时仍有剩余，避免中途温度回升。FFPE 蜡块可室温运输，但切片样本应避光防潮，因为切片暴露面积大，易吸湿和氧化。
保存方面，最需要强调的原则是分装、避免反复冻融。基因组 DNA 反复冻融 3 次以上，片段化程度会明显上升，尤其对 FFPE 来源的低质量 DNA 影响更大。建议提取后按 20～50 μL 分装，−20 ℃ 短期（数周）、−80 ℃ 长期（数月至数年）保存。血液样本若不能及时提取，可分离白膜层后 −80 ℃ 冻存，白膜层中白细胞富集，DNA 产量和完整性优于全血冻存。
三、样本质量评估指标与判读
WES 对样本质量的要求可以归纳为“量、纯、整”三个维度。量指 DNA 总量，常规 WES 建库需要 ≥ 1 μg，FFPE 因片段短、连接效率低，建议 ≥ 200 ng 且尽量提高投入量。纯指 OD260/280 和 OD260/230，前者反映蛋白污染，理想范围 1.8～2.0；后者反映盐、酚、多糖等污染，理想范围 ≥ 1.8。若 OD260/230 偏低，可用磁珠纯化或乙醇沉淀重新清洗。整指完整性，新鲜样本用 DIN 或 RIN 评估，DIN ≥ 7 为合格；FFPE 样本用 DV200 评估，DV200 ≥ 30% 通常可满足 WES 建库要求，低于 20% 时需谨慎评估或改用专门的低质量 DNA 建库方案。
需要特别提醒的是，浓度高不等于质量好。一份 OD260/280 为 1.5、DIN 为 4 的样本，即使浓度达到 100 ng/μL，建库后也可能出现插入片段偏短、重复率升高、外显子覆盖不均等问题。因此质量评估必须多项指标联合判读，不能只看单一数值。
四、常见问题与处理策略
问题一：血液样本溶血。溶血会释放血红素和铁离子，抑制 PCR 并增加背景。轻度溶血可尝试用红细胞裂解液洗涤白细胞后再提取；重度溶血建议重新采样。
问题二：唾液样本人源 DNA 占比低。表现为建库后比对率低、细菌序列比例高。处理方式是增加人源细胞富集步骤，或改用口腔拭子采集，减少食物残渣和细菌干扰。
问题三：FFPE DNA 片段过短。DV200 低于 20% 时，常规建库接头连接效率显著下降。可改用单链连接或基于转座酶的低投入建库方案，同时增加 PCR 循环数，但需注意循环数过高会引入偏好性。
问题四：组织样本肿瘤细胞含量不足。肿瘤细胞占比低于 20% 时，体细胞突变检测灵敏度下降。应在病理指导下进行宏观切割或激光显微切割，富集肿瘤区域后再提取 DNA。
把上述采集、运输、保存和质量评估环节串起来看，WES 样本工程的核心逻辑是：在样本进入建库之前，尽可能保留高分子量、低污染、足量的人源 DNA。血液和新鲜组织相对可控，唾液和 FFPE 则需要更严格的采集规范和质量门槛。理解每一类样本的“脆弱点”在哪里，才能在实际项目中提前规避风险，而不是等到测序数据出来后再回头排查。