📚 课程目录第4章物种注释与分类单元（OTU/ASV）

4、物种注释与分类单元（OTU/ASV）归纳总结

这一章咱们聊聊 OTU 和 ASV。这两个概念是宏基因组可视化的地基。你想想看，我们拿到一堆测序 reads，第一步就是把它变成可以统计的“特征单元”。怎么变？靠聚类或去噪。说白了，OTU 是老的玩法，ASV 是新的主流。

我自己做项目的时候，早期用 OTU 比较多，后来发现 ASV 在分辨率和可重复性上确实强不少。但这不代表 OTU 没用——有些老数据集、或者某个特定数据库，还是得用 OTU。咱们得两手准备。

4.1 先搞清楚：OTU 和 ASV 到底是什么？

OTU（Operational Taxonomic Unit）：操作分类单元。把相似度 ≥97% 的序列归到一个桶里，每个桶就是一个 OTU。这个 97% 阈值，我当年做的时候就被导师要求改成 99%，后来发现不同的研究差异挺大。
ASV（Amplicon Sequence Variant）：扩增子序列变异。不设阈值，直接对每个 unique 序列进行纠错后保留。分辨率高到单碱基差异。

举个例子：你手上有 10 条序列，其中 9 条一模一样，1 条差了一个碱基。用 OTU（97%），它们很可能会被归到同一个 OTU；用 ASV，它们会变成两个独立的 ASV。哪个更准？看你的研究目的。

我个人习惯：做功能预测或追踪菌株传播时优先用 ASV；做群落 β 多样性粗筛或者想跟历史数据对比时，OTU 更稳。

4.2 OTU 聚类 vs ASV 去噪

对比维度	OTU（如 UPARSE、VSEARCH）	ASV（如 DADA2、Deblur）
核心算法	通过聚类合并相似序列	通过错误模型去噪，保留单碱基差异
分辨率	低（一个 OTU 可能包含多个近缘种）	高（可区分单碱基差异）
可重复性	受聚类阈值和参考数据库影响大	相对稳定，不同管道结果接近
计算资源	内存需求中等，速度快	内存需求较高，尤其大样本
输出类型	OTU 表 + 代表性序列	ASV 表 + 代表性序列
常用工具	QIIME1/2（vsearch）、USEARCH	QIIME2（dada2, deblur）

我记得有一次帮学生处理一批土壤样本，用 DADA2 跑出来 2300 个 ASV，换成 97% OTU 只有 1200 个 OTU。后来比对发现，丢失的那 1100 个里有一半是低丰度的新物种。所以，选方法前要想清楚：你想要灵敏度还是稳定性？

4.3 实战流程：从 FASTQ 到特征表

不管用哪种方法，大流程是一样的。我画了一张图，帮你把关键步骤串起来。

讲一个具体的命令。我用 QIIME2 做 ASV 的流程是这样的：

# 导入数据
qiime tools import \
  --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
  --input-path manifest.txt \
  --output-path paired-end.qza \
  --input-format PairedEndFastqManifestPhred33

# 使用 DADA2 去噪
qiime dada2 denoise-paired \
  --i-demultiplexed-seqs paired-end.qza \
  --p-trunc-len-f 240 \
  --p-trunc-len-r 210 \
  --o-representative-sequences rep-seqs.qza \
  --o-table table.qza \
  --o-denoising-stats stats.qza

# 输出摘要
qiime feature-table summarize \
  --i-table table.qza \
  --o-visualization table.qzv

小贴士：参数 --p-trunc-len 要根据你的测序质量和目标片段长度来调。我一般先看质量报告，再决定切多少。切太狠会丢信息，切太少会引入错误。

4.4 注释与分类赋税：怎么给特征取名？

有了特征表，下一步是告诉每个 OTU/ASV 它是什么菌。这要靠参考数据库。常用的有：

SILVA（16S/18S）：覆盖面最广，但更新较慢。我主力用它。
Greengenes：老牌，但已经停更多年了。除非你要跟2013年以前的数据对比，否则别用了。
GTDB（基因组分类数据库）：基于全基因组，分辨率高，但只适用于细菌和古菌。
UNITE：专门针对真菌 ITS 区域。

注释代码也很简单（以 SILVA 为例）：

qiime feature-classifier classify-sklearn \
  --i-classifier silva-138-99-nb-classifier.qza \
  --i-reads rep-seqs.qza \
  --o-classification taxonomy.qza

qiime metadata tabulate \
  --m-input-file taxonomy.qza \
  --o-visualization taxonomy.qzv

避坑指南：我曾经遇到过数据库版本不一致导致注释率极低的问题。比如你用的 SILVA 138.1 的 classifier，但参考序列是从 SILVA 132 建的，匹配度会差很多。每次换数据库版本，记得重建 classifier。

4.5 归纳总结：合并、过滤、排序

拿到特征表和注释后，需要整理成最终用于可视化的格式。关键动作：

合并：如果你有多个批次的数据，用 qiime feature-table merge 合并特征表。
过滤：去除低丰度（比如总丰度<10）、未注释（“Unassigned”）的特征。我常用的命令：

# 过滤掉未注释的
qiime taxa filter-table \
  --i-table table.qza \
  --i-taxonomy taxonomy.qza \
  --p-exclude 'Unassigned' \
  --o-filtered-table filtered-table.qza

# 过滤掉在所有样本中总计数小于5的稀有特征
qiime feature-table filter-features \
  --i-table filtered-table.qza \
  --p-min-frequency 5 \
  --o-filtered-table final-table.qza

排序：按门/纲/目/科/属层级汇总。这一步可以在可视化工具里做，但也可以在 QIIME2 里先导出成 CSV。

我个人的经验：过滤时别太狠。比如把 min-frequency 设成 10，一些稀有但关键的指示物种可能就被去掉了。建议先做一次完整表可视化，看看哪些特征在低丰度区域有模式，再手工决定阈值。

4.6 可视化前的数据检验

最后一步也是容易翻车的一步：检查数据完整性。

样本覆盖度：是否所有样本都保留了足够的 reads？用 feature-table summarize 的 qzv 文件看一眼。
分类层级缺失：很多工具在可视化饼图或树图时，要求每个特征至少有界、门、纲、目、科、属 6 级注释。如果某一级丢失（比如“uncultured”），需要手动补成“Others”或者用 qiime taxa collapse 聚合到上一级。
稀疏曲线：如果有时间，跑一个稀疏曲线看测序深度是否够。不够的话，可视化里的 alpha 多样性会不可信。