FastQC 基础：运行参数、单端/双端数据输入、生成 HTML 报告

本章我们聊 FastQC。这东西可以说是 RNA-seq 质控的第一步，也是我最常用到的工具。你拿到测序数据后，第一件事就是跑 FastQC 看看质量怎么样。说白了，它就是个“体检报告”，告诉你原始数据有没有毛病。

我刚开始做生信时，直接拿别人的脚本跑完就完事了。有一次跑完才发现双端数据只输入了一个文件，结果报告全是单端的结果……嗯，后来我就养成了每次检查参数的习惯。

1. 认识 FastQC

FastQC 是一个轻量级的 QC 工具。它能快速扫描 FASTQ 文件，给出十几个维度的质量指标。核心模块包括：

  • 碱基质量分布（Per base sequence quality）
  • 序列 GC 含量（Per sequence GC content）
  • 接头污染（Adapter content）
  • 重复序列（Overrepresented sequences）
  • 碱基含量偏倚（Per base sequence content）
  • …… 一共 11 个模块

你想想看，每个模块都会给出一个评价：通过（绿色）、警告（黄色）或失败（红色）。这样一眼就能看出哪里有问题。

我的个人习惯： 拿到新数据后，先跑 FastQC 看一下整体轮廓。不需要太纠结单个指标，重点看绿色和黄色的比例。如果大片红色，那就得考虑是不是建库出了问题。
FastQC 工作流程 输入 FASTQ 文件 单端 / 双端 运行参数 --extract --threads 11 个分析模块 碱基质量 / GC / 接头 HTML 报告 交互式图表 结果解读 绿 / 黄 / 红 双端数据需要分别输入两个 FASTQ 文件，FastQC 会独立生成两个 HTML 报告。

2. 单端与双端数据输入

FastQC 默认支持单端和双端。双端数据其实是分别跑两个文件，不会合并分析。你给两个文件，它就出两个报告。

数据模式命令行示例说明
单端
fastqc sample_R1.fastq.gz -o qc_reports/
一个文件一个报告
双端
fastqc sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz -o qc_reports/
两个文件各自报告
批量
fastqc *.fastq.gz -o qc_reports/
通配符一次跑全部

我记得有一次做双端测序项目，同事只用了 R1 文件跑 FastQC，结果 R2 质量明显差却根本没发现。后来我检查时才发现 R2 的接头污染严重。所以我的建议是：双端数据一定两个文件都跑，不要偷懒。

3. 运行参数详解

FastQC 的参数不多，但有几个很实用。我整理一下常用的：

fastqc \
  --outdir ./qc_output \
  --threads 4 \
  --extract \
  --noextract \
  --nogroup \
  --kmers 7 \
  sample.fastq.gz

逐个说说：

  • --outdir：指定输出目录。不指定的话 HTML 和 zip 会生成在当前目录，很乱。我一般都会建个 qc_reports/ 文件夹统一存放。
  • --threads：多核并行。建议和 CPU 核心数一致，但不能超过文件数（比如只有一个文件，--threads 8 也没意义）。
  • --extract：解压 zip 包，直接得到文本格式的统计文件。后续用 MultiQC 汇总时常用。
  • --noextract：不解压。如果你只要 HTML 报告看个大概，用这个节省磁盘。
  • --nogroup：不分组。默认 FastQC 会把 binned 统计，不分组会逐碱基展示，更精细，但报告会很大。
  • --kmers：设置 k-mer 长度检测，默认 7。测序偏倚较大时可以改大，但一般别动。
曾经踩过的坑： 有一次我用 --threads 32 跑，结果系统内存爆了。因为 FastQC 多线程是每个线程独立加载文件，文件太大时内存会成倍增长。建议大文件时先试试 4 线程，看内存能顶住再加。

4. 生成 HTML 报告与解读

跑完之后，你会得到两个输出：一个 .html 文件和一个 .zip 压缩包（如果不加 --noextract）。HTML 是主报告，用浏览器打开就能看。

报告长什么样？上面是摘要表格，左边是导航，右边是详细图表。我通常会直接看右边每个模块的图表，重点关注：

  1. Per base sequence quality：Boxplot 中位数应在绿色区域（Q ≥ 28），低于 Q20 的区域要警惕。
  2. Per sequence GC content：理论分布是正态分布，如果出现双峰可能是污染或建库偏倚。
  3. Adapter content：如果在 3' 端出现曲线上升，说明接头没切干净。
  4. Overrepresented sequences：具体序列占比过高，可能是指标污染或 PCR duplicates。

我习惯先看 Per base sequence quality 和 Adapter content 这两个。如果质量没问题，其他模块即使出现黄色警告，也可以先忽略——很多是因为测序本身的技术偏差，不会影响下游分析。

我的经验： 当遇到大量红色失败模块时，别慌。先检查是否输入了正确的文件（是不是把双端混成单端了），再检查测序原始数据有没有被意外截断。有一次我发现全是红色的原因是文件名匹配错了，跑成了空文件。

5. 避坑指南

  • 文件格式： FastQC 支持 .fastq、.fastq.gz、.bam、.sam。但 .bam 只能分析比对后的质量，不适用于原始 RNA-seq。我个人只推荐用原始 FASTQ。
  • 大文件处理： 超过 2GB 的 gz 文件最好提前分割或用 --threads 控制。否则可能卡死。
  • 报告存放： 如果项目有多个样本，把所有 HTML 放在一个目录，后期用 MultiQC 合并汇总非常方便。我每次都这样做。
  • 版本差异： FastQC 0.11.9 之后的版本默认不显示 Kmer 曲线。如果需要，加 --kmers 7。老版本没有这个选项。

好了，FastQC 的基础就这些。下一步你可以在终端里跑一个例子试试。我个人建议先用一个小文件（比如 1M reads）跑一次，看看参数效果。这样心里有底，再上正式数据。

一个小技巧： 如果你在服务器上不方便打开浏览器，可以用 --extract 生成文本版报告，然后 less qc_reports/sample_fastqc/fastqc_data.txt 直接看。我经常这样快速查看“Per base sequence quality”的具体数值。
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